盛立嬌，彭毛，周建剛，宋功武

(湖北大學 有機功能分子合成與應用教育部重點實驗室，湖北 武漢 430062)

脫氧核糖核酸(DNA)是重要的生物大分子,也是遺傳信息的載體和基因表達的物質(zhì)基礎. 核酸的定量測定可為生物體體液中其他組分的測定及遺傳疾病的診斷提供重要信息,因而成為人們關注和研究的重要課題.DNA內(nèi)源熒光很弱,因而直接利用其天然熒光進行研究受到限制，共振光散射法逐漸成為研究熱點[1-5].

在早期的熒光分析中,散射光常作為一種干擾源而被消除.1993年,Pasternack等使用普通的熒光分光光度計建立了共振光散射(Resonance Light Scattering,RLS)技術,研究卟啉分子在DNA分子表面的組裝和聚集[1].黃承志等人在此基礎上做了大量的研究工作并將其作為高靈敏方法應用于核酸的測定[2-4].RLS法測定核酸主要利用具有大共軛體系的“生色團”(染料或金屬螯合物)在核酸分子上的聚集作用或長距組裝而產(chǎn)生強烈的共振散射,作為生色團的主要是有機小分子堿性染料,卟啉類試劑(如TAPP及其質(zhì)子化產(chǎn)物[2])及金屬螯合陽離子(如CO(Ⅱ)-5-Cl-PADAB螯合物[3])等.目前，利用增強有機染料共振光散射測定核酸的報道有藏紅T[4],羅丹明B[5],耐爾藍硫酸鹽[6],亮綠[7]和中性紅[8]等.

圖1 次甲基藍的分子結構

亞甲基藍(即次甲基藍，一種深藍色的水溶性染料，分子結構見圖1)已在近中性介質(zhì)中(pH 5.5～7.5)被作為共振光散射探針測定脫氧核糖核酸[9]，但在早期研究中只是作為一種新方法提出.筆者在文獻[9]的基礎上研究了次甲基藍(MB)在偏酸性介質(zhì)中(pH 3.51～4.49)與DNA作用的共振光散射光譜,對實驗條件進行了詳細優(yōu)化，并應用紅外光譜、紫外-可見吸收光譜等初步探討了MB與DNA作用的機理.

1 實驗部分

1.1儀器與試劑RF-540熒光分光光度計(日本島津); UV-2300紫外-可見分光光度計(美國PE公司); 傅立葉紅外光譜儀(美國PE公司);pHB-4 pH計(上海雷磁儀器廠); WH-2微型旋渦混流儀(上海滬西分析儀器廠).

Tris(三羥甲基氨基甲烷)- HCl 緩沖溶液,濃度為 0.1 mol·L-1; 脫氧核糖核酸溶液:將一定量的小牛胸腺DNA(ctDNA，華美生物工程公司)于0～4 ℃下緩慢溶于二次蒸餾水中,并于低溫保存，操作液濃度為90 mg·L-1.次甲基藍(MB)儲備液濃度為5.04×10-3mol ·L-1,操作液濃度為5.04×10-4mol·L-1.用1 mol·L-1的NaCl水溶液控制離子強度.所用試劑均為分析純,實驗用水均為二次蒸餾水.

1.2實驗方法在25 mL 比色管中依次加入0.3 mL MB溶液,適量DNA溶液,1.0 mL Tris-HCl 緩沖溶液,用二次蒸餾水稀釋至10 mL,旋渦混合,放置5 min.將溶液置于λem=λex處進行同步掃描,可得共振光散射光譜.于最大共振光散射峰368 nm處測量核酸加入前后溶液的共振光散射強度差ΔIRLS.

2 結果與討論

2.1 MB-DNA體系的共振光散射(RLS)光譜圖2為MB-DNA體系的共振光散射光譜(RLS光譜).結果表明,堿性染料次甲基藍本身的RLS信號較微弱,在加入DNA后,其RLS信號大大增強,在368、470、550 nm左右出現(xiàn)了增強的共振光散射峰,但368 nm處的增強信號較明顯且峰形較好,本實驗選擇368 nm為測量波長.

2.2條件優(yōu)化

2.2.1 介質(zhì)酸度的選擇 向海艷等[9]研究了亞甲基藍與脫氧核糖核酸在近中性范圍內(nèi)(pH=5.5～7.5)的共振光散射光譜.而本文以Tris-HCl 緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值,旨在研究偏酸性范圍內(nèi)，次甲基藍共振光散射法測定DNA含量的各種條件及有機染料與生物大分子的作用機理.Tris-HCl 緩沖溶液的用量在1.0～1.8 mL時RLS強度較大.因此，實驗選擇用1.0 mL pH=4.49的Tris-HCl 緩沖溶液控制介質(zhì)的酸度.

2.2.2 離子強度的影響 用1 mol·L-1的NaCl 水溶液控制離子強度,測定MB-DNA體系的共振光散射強度,實驗結果如圖3所示.由圖可知,當NaCl溶液的濃度小于0.01 mol·L-1時,溶液的離子強度對體系幾乎無影響；繼續(xù)增大離子強度則會導致體系RLS強度逐漸減小.因此,在體系中應避免有高濃度的電解質(zhì)存在,在配置緩沖溶液時,應盡量避免以電解質(zhì)作為緩沖介質(zhì).離子強度的影響從一定程度上說明了MB與DNA之間存在靜電相互作用[3].

2.2.3 試劑加入順序的影響及穩(wěn)定性實驗 實驗中試劑的加入順序?qū)LS影響不大，但當按照染料MB-DNA-緩沖溶液時,體系的共振光散射強度最大.按順序加入試劑,放置4～5 min后,反應基本完成,體系在至少35 min內(nèi)測定,結果穩(wěn)定.

2.2.4 DNA熱變性的影響 實驗研究了熱變性DNA(將DNA 在沸水浴中加熱30 min后迅速放入冰水浴中冷卻15 min以防止其復性)和天然DNA 對體系RLS 強度的影響,結果見圖4.由圖可知,熱變性DNA的共振光散射強度增大,這是由于高溫和迅速冷卻使得雙螺旋的DNA 解鏈為單鏈,有利于MB分子在DNA表面的堆積.

圖 2 MB-DNA 體系共振光散射光譜CMB:1.512×10-5 mol·L-1; pH=4.49;CDNA(mg·L-1)(1→4): 0.0,0.9,1.8,2.7.

圖3 離子強度對MB-DNA體系RLS的影響CMB:1.512×10-5 mol·L-1;pH=4.49;CDNA: 1.8 mg·L-1.

圖 4 天然DNA(1)和變性DNA(2)對體系RLS強度的影響CMB: 1.512×10-5 mol·L-1;pH=4.49.

2.2.5 共存物質(zhì)的干擾 在0.9 mg·L-1DNA 存在下,考慮了多種共存物質(zhì)對測定的影響,結果見表1.從表1 可以看出,大多數(shù)生物體內(nèi)存在的金屬離子(如Ca2+和Ba2+)和氨基酸以及糖類不干擾測定,說明該方法具有實際應用價值.由于Fe3+會與DNA發(fā)生絡合反應,干擾此實驗,故在實驗前,應將其除去.BSA對體系干擾很大,這是由于BSA與MB產(chǎn)生相似反應之故.

表1 共存物質(zhì)對測定DNA的影響

2.2.6 工作曲線 在上述確定的最佳反應條件下,繪制了測定DNA 的工作曲線.當DNA 的質(zhì)量濃度為0～1 440 ng·mL-1時,體系的共振光強度與DNA 的質(zhì)量濃度呈較好的線性關系.其工作曲線的線性擬合方程為ΔIRLS=-2.442 + 49.765C(C: mg/L)(pH=4.49),相關系數(shù)為r=0.995 3.該方法檢測限(3σ)為14.1 ng·mL-1.

2.2.7 合成樣品的測定 根據(jù)表1 中共存離子組分干擾允許量配置了3個合成樣品.表2列出了合成樣品的測定結果,證明此法重復性好,結果令人滿意.

表2 合成樣品中DNA的測定

3 機理探討

有機分子與生物大分子相互作用的機理是研究的熱點，已有人使用分子吸收和發(fā)射光譜及圓二色譜等方法進行研究[10-11]，本文中是在應用RLS法測定DNA含量的實驗基礎上，綜合應用紅外光譜、紫外-可見吸收光譜、RLS光譜等光譜技術，并結合離子強度對體系RLS信號的影響來初步探討MB與DNA作用的機理.

圖 5 MB-DNA 體系的紅外光譜(1)DNA,(2)MB-DNA.

3.2 RLS光譜除了可以應用RLS法靈敏測定生物大分子的含量外，還能根據(jù)共振光散射光譜研究有機分子在核酸分子表面的長距組裝.根據(jù)文獻[6,10-11]解釋,帶正電荷的有機分子對核酸具有凝聚作用(condensing effect),當有機分子與核酸的摩爾比較高且介質(zhì)的離子強度很低時,有機分子在核酸分子表面進行長距組裝(long range assembly),形成遠程堆積結構并將誘導核酸超螺旋結構的形成,當光與核酸的超螺旋結構作用時便產(chǎn)生了光共振現(xiàn)象，導致共振光散射增強.因而，如果有機分子與核酸作用時導致強烈的RLS信號增強，則意味著該有機分子在核酸表面進行堆積，形成了一種核酸超螺旋結構.本實驗中，MB與DNA的結合，從圖1看出,隨著DNA的加入,體系的共振光散射增強,可初步說明MB分子在DNA分子表面長距組裝,形成大的聚集體.

圖 6 MB-DNA體系吸收光譜CMB: 1.512×10-5 mol·L-1; pH=4.49;CDNA(mg·L-1)(1-8):0.0,2.7,4.5,13.5,22.5,45.0,63.0,88.2.

3.3紫外-可見吸收光譜次甲基藍(MB)，吖啶橙(AO)，耐爾藍A(NB)，中性紅(NR)，羅丹明6G(R6G)等離子型染料在水溶液中都存在單體(M)-二聚體(D)平衡(the monomer-dimer equilibrium,M+M=D)[12].次甲基藍，別名品藍，屬于醌亞胺類染料，可用作染料，生物染色劑，氧化還原指示劑等，水溶液中其單體的吸收峰位于668 nm處，而二聚體的吸收帶位于612 nm處[13].圖6為體系的紫外-可見吸收光譜.圖6曲線1中612 nm即MB二聚體的吸收峰，而664 nm處即單體吸收.由圖可知,當DNA加入已發(fā)生聚集的MB溶液中,體系在664 nm處的吸收下降(曲線1～4),發(fā)生減色效應并伴隨著波長紫移.根據(jù)共振光散射理論，增強的RLS信號與紫外光譜的減色效應，可進一步確定MB在DNA分子表面的堆積和長距組裝[4].當DNA的質(zhì)量濃度繼續(xù)增大,吸收峰又開始增大,波長紅移.其原因有二，可能是隨著MB單體與DNA反應,單體-二聚體平衡朝單體方向移動,使二聚體(D)濃度降低[9].此外，當DNA濃度增加到一定值后，MB與DNA的作用可能經(jīng)歷了從表面聚集(H-aggregation)到解聚(dissociation mechanism)的轉(zhuǎn)變[4],不利于MB與DNA的反應.

3.4從離子強度的影響角度探討作用機理從微觀上分析，有機小分子與核酸結合的部位是堿基,磷酸骨架和戊糖環(huán),作用的方式主要分為3種:不可逆的共價結合,剪切結合和可逆的非共價結合[14].其中非共價作用是研究的熱點,其基本方式有:靜電作用、溝槽作用、嵌插作用和遠程組裝與外圍結合(亦稱長距組裝)幾種方式[14].靜電作用主要是陽離子小分子沿著核酸雙螺旋結構的雙壁與負電荷的磷酸根發(fā)生反應,小分子與核酸的這種相互作用可根據(jù)離子強度對測定體系的影響進行判斷[15].

由圖3看出，當NaCl溶液的濃度大于0.01 mol·L-1后，繼續(xù)增大離子強度則會導致體系RLS強度逐漸減小，這是因為MB的分子結構中環(huán)外N原子帶正電荷，可與DNA骨架上帶負電荷的磷酸基團作用，而Na+也能以靜電引力的方式與磷酸基相互作用，從而離子強度的增大削弱了陽離子染料MB與DNA之間的靜電引力，不利于次甲基藍與DNA的結合.據(jù)此分析，MB與DNA的結合有一定的靜電作用.

綜合上述分析可知,MB可能通過靜電作用等以DNA分子為模板在其表面形成了聚集和長距組裝,這種聚集增強了體系的RLS響應[3],并成為定量測定核酸的基礎.

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