彭毛,祁紅林,吳輝,盛立嬌,周建剛,宋功武

(湖北大學 化學化工學院,湖北 武漢 430062)

Scheme 1 EY的分子結構式

曙紅Y(Eosin Y,EY)是一種陰離子型光譜探針,主要以靜電作用力與蛋白質(zhì)結合[1],已被廣泛應用于蛋白質(zhì)[2]、殼聚糖[3]、藥物[4-5]及表面活性劑[6]的檢測,以及與生物大分子作用的機理研究[7]等.生物大分子擁有復雜的立體構象,折疊、螺旋、盤繞等使大分子產(chǎn)生大量的溝壑和空穴,同性電荷相互靠近形成很多微電場谷[8].由于電場的作用,帶有電荷的小分子探針被吸附到微相電場表面.EY分子在溶液中帶有負電荷,與帶正電荷物質(zhì)存在靜電作用.本文中研究了EY與牛血清白蛋白(BSA)的結合作用,計算出了結合比,結合常數(shù)等,并進行了試驗條件討論,測定了蛋白質(zhì)的工作曲線.EY的分子結構式,如Scheme 1所示：

1 實驗部分

1.1儀器與試劑UV 2300分光光度計(上海天美科學儀器有限公司)；WH-3微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；TB-85型恒溫水浴槽(Shimadzu)；準確稱取一定量牛血清白蛋白(BSA)(武漢天源生物技術有限公司,66 000 g/mol),配制成2.12×10-5mol/L的水溶液,置于4 ℃下保存；曙紅Y(EY)(上海試劑三廠),儲備液濃度為1.01×10-3mol/L；試驗用水均為二次去離子水,其他無機鹽試劑未標明的均為分析純.

1.2實驗方法在25 mL 比色管中加入0.2 mL EY 溶液和一定量的BSA 溶液,稀釋至12.5 mL 刻度處,漩渦混勻,放置6 min 后用1 cm 比色皿測其在534、511 nm 處的吸光度,根據(jù)公式(1～7)計算各個參數(shù),并繪制Langmuir等溫吸附曲線.

2 結果與討論

2.1基本原理蛋白質(zhì)分子由于復雜的立體構象形成微弱靜電場[9],在其作用下,帶電荷的小分子以單分子層形式被吸附到微相電場表面.由于生化反應平衡方程與吸附劑在溶液中對吸附質(zhì)分子的蛋分子層吸附一致,故使用Langmuir 單分子層等溫吸附理論解釋蛋白質(zhì)分子與小分子間相互作用是可行的[10].

Langmuir等溫吸附方程為：

γ-1=N-1+(KNCL)-1

(1)

γ=η×CL0/CS

(2)

CL=(1-η)CL0

(3)

η=(AC-ΔA)/A0

(4)

AC=(ΔA-βΔA′)/(1-αβ)

(5)

η是L的有效反應率；CS是蛋白的初始濃度；CL0是染料的初始摩爾濃度.A0、ΔA分別是以水為參比試劑空白、以試劑空白為參比結合產(chǎn)物在結合產(chǎn)物最大吸收波長λ2下所測得的吸光度；AC是結合產(chǎn)物在λ2下經(jīng)光譜修正后的實際吸光度；ΔA′是結合產(chǎn)物以試劑空白為參比在結合產(chǎn)物峰谷λ1下測得的吸光度；α、β為光譜校正常數(shù),計算公式分別為：

(6)

(7)

2.2吸收光譜分析EY溶液及其與BSA的反應溶液的吸收光譜圖如圖1所示.在400～600 nm 范圍內(nèi),EY在514 nm 處有一最大吸收峰,當加入BSA 后,最大吸收峰紅移至 527 nm 波長處,吸光度值降低.當以試劑空白為參比時,結合產(chǎn)物的吸收峰和谷吸收分別為 534 nm和511 nm,選此二波長為測定波長λ2、λ1.

圖1 EY及EY-BSA結合產(chǎn)物的A值EY: 1.62×10-5 mol/L; BSA: 6.86×10-6 mol/L.

圖2 吸光度比值隨VBSA的變化曲線EY: 1.62×10-5 mol/L;BSA: 4.21×10-5 mol/L.

固定EY 的用量,向溶液中加入不同體積的BSA 溶液,以試劑空白為參比,計算其谷與峰處的吸光度比值,如圖2所示.當BSA 加入量(VBSA)大于1.4 mL 時接近最小并基本保持恒定,這表明蛋白用量超過1.4 mL 時溶液中已沒有游離的 EY,據(jù)此可以計算出α=0.634 4.以水為參比,由EY 溶液的吸收光譜中534 nm和511 nm 處的吸光度值,根據(jù)公式(7)計算出β=0.183 5.

2.3反應條件的研究

2.3.1 反應時間的影響 加入一定量的EY和BSA溶液后,在不同反應時間下測其吸收曲線,研究結合比γ隨時間的變化.結果顯示,EY與BSA的在室溫下(26 ℃)反應速度較快,在6 min 后體系基本達到穩(wěn)定且在半小時內(nèi)都能保持不變,因此選擇溶液放置 6 min 后進行測量.

2.3.2 離子強度的影響 加入不同量1.0 mol/L NaCl 溶液實驗離子強度的影響,反應液的離子強度的變化對EY-BSA結合物的結合比的影響結果如圖3所示.從圖中可看出,EY-BSA結合物的結合比γ隨離子強度的增加而降低.這是由于Na+、Cl-濃度高時,也能被蛋白質(zhì)中的微電場所吸附,占據(jù)了部分微相表面,從而使EY 的吸附有所減少,結合比減小.

2.3.3 溫度的影響 在25～52 ℃ 溫度范圍內(nèi)研究了EY-BSA結合反應的吸收隨溫度變化的情況,結果如圖4所示,可見,結合比隨溫度的升高而逐漸減小.這是由于溫度升高加快了吸附在蛋白質(zhì)分子上的EY解離,造成溶液中游離態(tài)的EY濃度升高,結合比下降.這些現(xiàn)象符合固體表面單分子層吸附的一般規(guī)律,支持了生物大分子內(nèi)微靜電場假設.

2.4結合常數(shù)的測定固定EY的用量,改變BSA(2.12×10-5mol/L)溶液的加入量.分別在30、45和60 ℃下,按實驗方法測定反應液在吸收峰(534 nm)和谷(511 nm)處的吸光度值,分別計算AC、η、CL、γ值等,繪制1/γ-1/CL曲線,如圖5所示.

圖3 離子強度對EY-BSA體系的影響B(tài)SA: 3.19×10-6 mol/L; EY: 8.08×10-6 mol/L.

圖4 溫度對EY-BSA結合比的影響B(tài)SA: 3.19×10-6 mol/L;EY: 8.08×10-6 mol/L.

圖5 EY-BSA體系的1/γ - 1/CL 關系曲線圖BSA: 3.19×10-6 mol/L.

由圖可見,各曲線均有較好的線性關系,因此曙紅Y與BSA的結合符合Langmuir 單分子層吸附,即微相表面吸附.

根據(jù)直線的斜率和截距可分別求得各溫度下結合物的結合常數(shù)及最大結合數(shù),見表1.可見,溫度的升高,EY的結合常數(shù)降低,這是由于溫度的升高,吸附在蛋白質(zhì)表面上的EY分子的解離加速,從而導致結合常數(shù)減小.

表1 EY-BSA體系在不同溫度下的結合常數(shù)

2.5蛋白質(zhì)溶液的工作曲線配制系列牛血清白蛋白標準溶液,按實驗方法測量,計算AC值,測定蛋白質(zhì)的工作曲線.結果表明,蛋白質(zhì)在0～0.20 g/L濃度范圍內(nèi)吸收是線性的：AC=1.494 9C+ 0.010 18(R=0.997 6),該方法的檢出限為 20 mg/L.

2.6金屬離子的干擾在相對誤差為±5%時,分別往一定量的結合反應體系中加入各種金屬離子,對3.19×10-6mol/L BSA溶液測定它們的干擾情況,結果列入表2中.由結果可知,這些物質(zhì)的干擾較小,不影響直接測定.

表2 金屬離子干擾情況

3 結論

本試驗探討了曙紅Y在蛋白質(zhì)上的吸附聚集反應,由結果可知,溫度的升高,加快了吸附在BSA上的EY分子的解離,造成溶液本體EY濃度升高,這一現(xiàn)象符合固體表面單分子層吸附的一般規(guī)律.通過Langmiur單分子層等溫吸附理論研究,表明該過程符合Langmuir 等溫吸附,同時也支持了生物大分子內(nèi)微靜電場假設.該方法原理簡單易懂,操作方便,結果可靠,對研究環(huán)境污染物在生物大分子上的聚集機理與毒性作用等有重要意義.

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