鄧勝國,鄧澤元,范亞葦,單 斌

南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,南昌大學(xué)高等研究院,南昌 330047

荷葉中紫云英苷和牛血清白蛋白相互作用的光譜學(xué)研究

鄧勝國,鄧澤元＊,范亞葦,單 斌

南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,南昌大學(xué)高等研究院,南昌 330047

本文采用熒光光譜法、紫外光譜法研究在生理條件(pH=7.4)下荷葉中紫云英苷 (AST)與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。結(jié)果表明AST可與BSA結(jié)合并通過靜態(tài)猝滅作用機制對BSA內(nèi)源性熒光進行猝滅。在溫度為 298 K及 308 K時,測得其猝滅速率常數(shù) (Kq)分別為 4.31×1013L/mol/s和 3.72×1013L/mol/s;結(jié)合常數(shù) (Kd)分別為 2.009×105L/mol和 0.927×105L/mol;結(jié)合位點數(shù) (n)分別為 0.943和 0.893。依據(jù) 298 K時測定的反應(yīng)自由能變 (△G0=-30.25 kJ/mol),反應(yīng)焓變 (△H0=-59.02 kJ/mol)及反應(yīng)熵變 (△S0=-96.54 J/ mol/K),結(jié)果發(fā)現(xiàn)AST與BSA間的結(jié)合反應(yīng)可自發(fā)進行且其作用力主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力。此外,根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論得到AST與 BSA之間的結(jié)合距離 (r)為 4.13 nm,表明非輻射能量可從 BSA轉(zhuǎn)移至AST。

荷葉;相互作用;紫云英苷;牛血清白蛋白;熒光光譜;能量轉(zhuǎn)移

血清白蛋白(Serum Albumin,SA)是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì),它能結(jié)合許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì),并能將這些物質(zhì)輸送到身體的各個部位,因此研究血清白蛋白與藥物分子的相互作用,對了解藥物在人體內(nèi)的藥理活性、吸收、分布及排泄等具有十分重要的意義。荷葉主要的活性成分是黃酮類化合物,具有解暑清熱、生發(fā)清陽、散瘀止血等功效,已成為研究、利用的熱點[1-3],但是目前國內(nèi)尚無研究紫云英苷(從荷葉中分離純化得到的一種黃酮苷類化合物,化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖 1)與牛血清白蛋白相互作用的相關(guān)報道。熒光光譜分析法因本身具有簡便、快速、靈敏等優(yōu)點已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的研究中,本文采用熒光光譜法較詳盡地研究了荷葉中的紫云英苷與牛血清白蛋白間的相互作用,并根據(jù)實驗處理相關(guān)的光譜數(shù)據(jù),首次計算得出紫云英苷與BSA之間的猝滅速率常數(shù) (Kq),結(jié)合常數(shù) (Kd),結(jié)合位點數(shù)(n),熱力學(xué)參數(shù) (△G0,△H0,△S0)及二者間的結(jié)合距離(r),力求從分子水平探討紫云英苷與 BSA相互作用的機制,以期為進一步設(shè)計和篩選藥用效果更加明顯、毒副作用更小的新型藥物提供科學(xué)的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

F-2500型熒光光度計 (日本日立公司);UV-2450紫外-可見分光光度計 (日本島津公司);pHS-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠);DK-98-Ⅱ型恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);Finnpipette可調(diào)式移液槍(美國芬蘭雷勃公司)。

牛血清白蛋白 (BSA,Fraction V,相對分子質(zhì)量65000,北京華美生物工程有限公司),用0.05 mol/L的NaCl溶液配制成 6.25×10-5mol/L的溶液,溶液保存于 277 K的冰箱中備用;紫云英苷 (Astragalin,簡稱AST,本實驗室從荷葉中分離純化獲得,含量大于 95%)用甲醇溶解供試;pH=7.4的 Tris-HCl緩沖溶液;其他所用試劑均為分析純,實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

在 10 mL的平底小容量瓶中,分別加入 pH=7. 4的 Tris-HCl緩沖溶液 3 mL,0.05 mol/L的 NaCl溶液 3 mL,固定量的BSA及不同量的紫云英苷,以二次水定容至 10 mL,混合均勻后在一定溫度下恒溫。準(zhǔn)確移取3.0 mL該溶液于石英熒光池中,在激發(fā)波長為 280 nm(熒光激發(fā)和發(fā)射狹縫均為 5 nm,測量電壓 400 V)下,測定并記錄BSA的熒光光譜及紫云英苷對BSA的熒光猝滅光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫云英苷對BSA的熒光猝滅

蛋白質(zhì)分子中含有色氨酸和酪氨酸等芳香氨基酸殘基,在紫外光激發(fā)下,分子具有較強的內(nèi)源熒光發(fā)射。這種內(nèi)源性熒光容易受周圍環(huán)境的影響,諸如蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化,蛋白質(zhì)變性及蛋白質(zhì)與藥物分子發(fā)生結(jié)合反應(yīng)時,都會使蛋白質(zhì)熒光強度明顯減弱而導(dǎo)致熒光猝滅。由圖 2可知,當(dāng)激發(fā)波長固定為 280 nm時,BSA在波長 343 nm處可發(fā)射強烈的熒光,BSA發(fā)射的熒光強度隨著紫云英苷的不斷滴加而逐漸降低,但其最大熒光發(fā)射波長 (343 nm)并不發(fā)生偏移,峰形基本保持不變,表明 BSA可與紫云英苷發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生不發(fā)熒光的復(fù)合物導(dǎo)致BSA熒光的猝滅。熒光猝滅可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅兩類[4],二者通常可依據(jù)不同溫度下的測量結(jié)果得以區(qū)分。對靜態(tài)猝滅,溫度的升高將降低復(fù)合物的穩(wěn)定性,導(dǎo)致靜態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)隨溫度的升高而減小。相比之下,溫度的升高將增加分子間的有效碰撞和加劇電子轉(zhuǎn)移的速率,促使動態(tài)熒光猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增大。為了確定紫云英苷對BSA熒光猝滅的類型,先假設(shè)他們之間相互作用的類型為動態(tài)猝滅,根據(jù) Stern-Volumer方程[5]:

式中,Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù),Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù),τ0為猝滅劑不存在時熒光分子平均壽命 (生物大分子熒光壽命約為 10-8s[6]),[Q]為猝滅劑濃度(即紫云英苷的濃度),F0和 F分別為不添加和添加紫云英苷時BSA的熒光強度。

圖 3 紫云英苷在 298 K及 308 K下猝滅BSA熒光的Stern-Vo lmer曲線Fig.3 Stern-Vo lmer curves for the binding of BSA to AST at 298 and 308 K(cBSA=1.05×10-6mol/ L,λex=280 nm)

根據(jù)圖 3可得到線性方程 Y=4.31×105X+ 1.002,r=0.9993(T=298 K)及 Y=3.72×105X +1.021,r=0.9994(T=308 K),結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同溫度下的 Stern-Volumer圖均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系 (T =298 K,r=0.9993;T=308 K,r=0.9994),這表示紫云英苷對 BSA的猝滅形式只能是靜態(tài)猝滅或是動態(tài)猝滅[7]。同時可知它們的動態(tài)猝滅常數(shù) (T= 298 K,Ksv=4.31×105L/mol;T=308 K,Ksv=3.72 ×105L/mol)與溫度呈負相關(guān),表明紫云英苷對BSA的猝滅方式可能主要是靜態(tài)猝滅過程而不是動態(tài)猝滅,而相應(yīng)的雙分子猝滅過程速率常數(shù) (T= 298 K,Kq=4.31×1013L/mol/s;T=308 K,Kq=3. 72×1013L/mol/s)均大于各類猝滅劑對生物大分子最大擴散碰撞猝滅速率常數(shù) (Kq=2.0×1010L/ mol/s)三個數(shù)量級[8,9],這進一步證明紫云英苷對BSA的猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

圖 4 紫云英苷在 298 K及 308 K下猝滅 BSA熒光的雙對數(shù)回歸曲線圖Fig.4 Double logarithmic regression curves ofBSA fluorescence quenching caused byAST at 298 and 308 K(λex=280 nm,cBSA=1.05×10-6mol/L)

2.2 紫云英苷對BSA的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)的計算

由靜態(tài)猝滅而導(dǎo)致熒光體熒光強度減弱的過程,其熒光強度 F、猝滅劑濃度[Q]、結(jié)合常數(shù) Kd及結(jié)合數(shù) n之間的關(guān)系式表示如下[10,11]:

由圖 4可得線性方程 Y=0.943X+5.303,r= 0.9985(T=298 K)及 Y=0.893X+4.967,r= 0.9994(T=308 K)。結(jié)合數(shù)近似等于 1(T=298 K,n=0.943;T=308 K,n=0.893)表明每一個 BSA分子可與一個紫云英苷分子結(jié)合形成復(fù)合物,同時結(jié)合常數(shù) (T=298 K,Kd=2.009×105L/mol;T= 308 K,Kd=0.927×105L/mol)隨著溫度的增加而減少,這種變化趨勢和上面實驗計算得出的動態(tài)猝滅常數(shù) (Ksv)及相應(yīng)的雙分子猝滅過程速率常數(shù)(Kq)的變化趨勢一致,這表明紫云英苷分子與 BSA相互作用可能形成了不穩(wěn)定的復(fù)合物,并且當(dāng)溫度升高時這種復(fù)合物會部分分解而導(dǎo)致結(jié)合常數(shù)下降。這些結(jié)果同時也表明溫度對結(jié)合數(shù)及結(jié)合常數(shù)的影響較小,紫云英苷和BSA之間存在強烈的作用力,因此紫云英苷在體內(nèi)可被BSA貯存及運輸。

2.3 紫云英苷猝滅BSA熒光過程中熱力學(xué)參數(shù)的測定及分子間作用力類型的判斷

一般來講,藥物小分子與蛋白質(zhì)間的結(jié)合力主要有氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等四種類型。藥物不同,與蛋白質(zhì)作用力類型也不相同,而自由能變 (△G0),焓變 (△H0)及熵變 (△S0)是判斷藥物小分子與蛋白質(zhì)相互作用類型的主要熱力學(xué)參數(shù)。當(dāng)溫度變化不大時,反應(yīng)的焓變可視作常數(shù),熱力學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系可用下列方程來描述:

根據(jù)上述公式及不同溫度 (T1,T2)下的結(jié)合常數(shù) (Kd1,Kd2)計算出溫度為 298 K時紫云英苷與BSA反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)分別為△G0=-30.25 kJ/ mol,△H0=-59.02 KJ/mol,△S0=-96.54 J/mol/ K?！鱃0<0,表明紫云英苷與 BSA的結(jié)合反應(yīng)可自發(fā)進行,ΔH<0及ΔS<0,則可推斷它們之間的作用力主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力[12]。

2.4 紫云英苷對BSA作用距離的計算

根據(jù) F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[13],藥物小分子與血清白蛋白結(jié)合形成復(fù)合物的結(jié)合距離越小,則蛋白質(zhì)越容易儲存和轉(zhuǎn)運藥物分子,藥物分子更容易發(fā)揮其藥理活性。能量轉(zhuǎn)移效率 E與結(jié)合距離 r的關(guān)系為:

F為[BSA][紫云英苷]=1∶1(摩爾濃度比)時的BSA的熒光強度,F0為溶液中紫云英苷不存在時BSA的熒光強度,R0是轉(zhuǎn)移效率為 50%時的臨界距離。R0的計算公式如下:

K2為偶極空間取向因子,N為介質(zhì)折射指數(shù),Ф為給體的熒光量子產(chǎn)率,J為給體的熒光發(fā)射光譜與受體的紫外吸收光譜間的重疊積分。J的表達式如下:

F(λ)為熒光給體在波長為λ的熒光強度,ε (λ)為受體在波長為λ的摩爾吸光系數(shù),只要得到E,K2和N并通過實測光譜求出積分 J,則可計算出R0和 r。

圖 5 BSA的熒光光譜 (a)與紫云英苷紫外吸收光譜 (b)的重疊譜圖Fig.5 Overlapping of the fluorescence emission spectra of BSA (a)and UV absorption spectra of AST(b),T=298 K (cAST=1.05×10-6M,cBSA=1.05×10-6M,T=298K)

本實驗條件下,給體為 BSA,受體即為紫云英苷,取向因子為給體-受體各向隨機分布的平均值K2=2/3,折射指數(shù)為水和有機物的平均值 N= 1.336,BSA中色氨酸的量子產(chǎn)率 Ф=0.15[14]。BSA的熒光光譜與紫云英苷的紫外吸收譜有部分重疊(圖 5)。將圖 5中的光譜重疊部分割成極小的矩陣面積,并結(jié)合式(7)求和算得光譜的重疊積分為 J= 8.42×10-14cm3·L/mol,將這些數(shù)值代入式 (6)得到 R0=3.64 nm,同時利用紫云英苷與BSA摩爾濃度比為 1∶1時復(fù)合物的熒光強度,通過式 (5)求出能量轉(zhuǎn)移效率 E=0.287及求得紫云英苷距BS A分子色氨酸殘基最短離為 r=4.13 nm(r<7 nm),表明BSA與紫云英苷間可以發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移,紫云英苷的部分片斷能夠嵌插入BSA分子內(nèi)部。

3 結(jié)論

實驗表明紫云英苷可與 BSA以摩爾比 1∶1牢固結(jié)合并通過靜態(tài)猝滅作用機制對BSA產(chǎn)生強烈的熒光猝滅。通過計算熒光猝滅過程中的熱力學(xué)參數(shù),表明紫云英苷與BSA的結(jié)合反應(yīng)可自發(fā)進行且其作用力主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力。此外紫云英苷與BSA間的結(jié)合距離小于 7 nm,表明二者之間能夠發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移。因此紫云英苷分子的部分片斷能夠插入BSA分子內(nèi)部并與BSA形成復(fù)合物,可以被蛋白質(zhì)所貯存和運輸。

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Spectroscopic Investigation on the Interaction between Astragalin in LotusLeaf and Bovine Serum Album in

DENG Sheng-guo,DENG Ze-yuan＊,FAN Ya-wei,SHAN Bin
State Key Lab of Food Science and Technology,Institute forAdvanced Study,Nanchang University,Nanchang 330047,China

The interaction between astragalin(AST)in lotus leaf and bovine serum albumin(BSA)in physiological condition(pH=7.4)was studied by fluorescence spectroscopy and ultraviolet absorption spectroscopy.The results demonstrated thatAST could bind to BSA and quenched the intrinsic fluorescence of BSA through static quenching mechanis m.The quenching rate constants of biomoleculer,the binding constants,and the number of binding sites between AST and BSA were Kq=4.31×1013L/mol/s and 3.72×1013L/mol/s,Kd=2.009×105L/mol and 0.927×105L/mol,n =0.943 and 0.893 at 298 K and 308 K,respectively.According to the free energy change(△G0=-30.25 kJ/mol), the enthalpy change(△H0=-59.02 kJ/mol)and the entropy change(△S0=-96.54 J/mol/K)obtained at 298 K, the binding ofBSA to ASTwas found to be spontaneous and the interaction between BSA and ASTwas driven mainly by hydrogen bonds and van derWaals forces.In addition,based on the F?rster theory of non-radiation energy transfer,the binding distance(r=4.13 nm)between AST and BSA was close enough to transfer non-radiation energy from BSA to AST.

lotus leaf;interaction;astragalin;bovine serum albumin;fluorescence spectroscopy;energy transfer

1001-6880(2010)06-1081-05

2009-03-30 接受日期:2009-07-03

江西省教育廳 2003年重點項目(20030058);國家自然科學(xué)基金項目 (20562008);教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃項目(IRT0540)

＊通訊作者 Tel:86-791-8304402;E-mail:zeyuandengpaper@163.com

Q946.91;R284.1;TQ464.3;Q523

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