趙玉玲， 盧乃浩， 高中洪

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.華中科技大學(xué) 化學(xué)與化工系，湖北 武漢 430074)

高糖和外源性硝化試劑導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細胞蛋白質(zhì)硝化的研究*

趙玉玲1， 盧乃浩2， 高中洪2

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.華中科技大學(xué) 化學(xué)與化工系，湖北 武漢 430074)

采用細胞生物學(xué)及化學(xué)方法，檢測了高濃度的糖和外源性硝化試劑作用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞(ECV304)后所導(dǎo)致的細胞蛋白氧化損傷及硝化損傷.結(jié)果發(fā)現(xiàn):高濃度的糖(30和40 mmol/L)可以導(dǎo)致細胞發(fā)生氧化損傷，主要包括降低細胞存活率、降低胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)的含量、增加胞內(nèi)一氧化氮(NO)代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量;在細胞蛋白內(nèi)也檢測到蛋白質(zhì)硝化的產(chǎn)物.研究發(fā)現(xiàn):蛋白質(zhì)硝化可以進一步加強細胞損傷的程度,而高濃度的糖和外源性硝化試劑導(dǎo)致的細胞蛋白硝化有所不同，其原因可能是在糖尿病血管并發(fā)癥中蛋白質(zhì)是有選擇地發(fā)生硝化反應(yīng)的.

糖尿病血管并發(fā)癥；高濃度的糖;外源性硝化試劑；蛋白質(zhì)硝化；內(nèi)皮細胞

內(nèi)皮作為血液和間質(zhì)之間的半滲透屏障，可使水和小分子的交換容易進行，同時它還參與了代謝、合成以及調(diào)控途徑[1].內(nèi)皮功能的喪失會損害血管，該現(xiàn)象在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病中都有發(fā)生.在糖尿病以及糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展過程中，高濃度的糖可以產(chǎn)生活性氧已經(jīng)得到了公認[2-4].一氧化氮(NO)是最重要的血管舒張劑，同時參與了Ⅰ型糖尿病[5]和Ⅱ型糖尿病[6-7]的發(fā)生和發(fā)展.

氧化應(yīng)激發(fā)生時，氧自由基的生成增加，進而可以抑制過量產(chǎn)生的一氧化氮，產(chǎn)生更強的氧化劑如硝化酪氨酸殘基,損傷蛋白質(zhì)，生成硝化蛋白，已經(jīng)在糖尿病研究中得到了證實[8-9].在糖尿病病體內(nèi)，高濃度的糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞產(chǎn)生硝基酪氨酸,說明過氧亞硝基陰離子可能參與了糖尿病及糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病過程[8,10].但是對高濃度的糖導(dǎo)致內(nèi)皮細胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)硝化還知之甚少.

本文擬探討:(1)高濃度的糖是否可以損傷內(nèi)皮細胞?(2)高濃度的糖導(dǎo)致的硝化現(xiàn)象與外源性硝化試劑有何不同?

1 材料與方法

1.1試劑與藥品

兔多克隆抗3-硝基酪氨酸(3-NT)抗體購自Upstate公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L),增強化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑購自Pierce公司；D-葡萄糖、鄰苯二甲醛(OPA)、谷胱甘肽(GSH)、氯高鐵原卟啉(hemin)、葡萄糖氧化酶(GOx，用于體內(nèi)持續(xù)釋放H2O2)及煙酸己可堿(Hoechst33342)均購自Sigma公司；溴化-4,5-二甲基-2-噻唑基-2,5-二苯基氮唑(MTT，噻唑藍)及細胞培養(yǎng)所需物品均購自Gibco公司；亞硝酸鹽(nitrite)及其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2主要實驗儀器

SPECTR Amax PLUS384型酶標(biāo)儀,倒置熒光顯微鏡,凝膠成像系統(tǒng)及凝膠分析軟件,DYY-7C型電泳儀,DYC-40C型半干電轉(zhuǎn)移槽,RF-5301型熒光分光光度計,Beckman高速離心機,Beckman P/ACETMMDQ型毛細管電泳儀,SSQ-H型不銹鋼水浴鍋.

1.3細胞培養(yǎng)

人臍靜脈內(nèi)皮細胞系(ECV304)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國武漢).單層貼壁生長，上皮狀，用含10%新生小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)基于37 ℃,含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每隔1 d進行細胞換液，每隔3 d傳代1次.為了保證細胞株的穩(wěn)定性，用于進行實驗的細胞傳代不超過8代.分別將1×105個/mL細胞接種至24孔培養(yǎng)板、6孔培養(yǎng)板、35 mm培養(yǎng)皿和10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，當(dāng)細胞培養(yǎng)到有大約80%融合時，換入無血清培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h，然后進行分組培養(yǎng)72 h.細胞分組如下：正常對照組(Blank，正常葡萄糖濃度的完全培養(yǎng)基)、高糖Ⅰ組(HG30，在正常濃度葡萄糖的基礎(chǔ)上增加D-葡萄糖至終濃度為30 mmol/L)、高糖Ⅱ組(HG40，在正常濃度葡萄糖的基礎(chǔ)上增加D-葡萄糖至終濃度為40 mmol/L)和hemin-nitrite-H2O2體系(hemin，2.0 μmol/L；nitrite，0.75 mmol/L；GOx，2.0 mU/mL).

1.4細胞存活率測定

細胞存活率通過對培養(yǎng)的細胞內(nèi)固定的脫氫酶活性進行MTT測試得到[11].

1.5細胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)含量測定

細胞內(nèi)GSH含量的測定參照文獻[12]中的方法進行，對于細胞的處理則參照文獻[13]的方法進行了修改.

1.6細胞內(nèi)外一氧化氮(NO)含量測定

用毛細管電泳法測定細胞內(nèi)亞硝酸鹽及培養(yǎng)基中硝酸鹽的含量，以此反映高糖導(dǎo)致細胞內(nèi)外產(chǎn)生的NO的含量.

1.6.1 培養(yǎng)基中硝酸鹽含量測定

用等體積的三氯乙酸(TCA，20%)溶液沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)，混勻，靜置30 s，以8 000 r/min離心15 min，棄沉淀;取上清再重復(fù)一次離心過程.棄沉淀，上清液用于測定細胞外的硝酸鹽含量.

1.6.2 細胞內(nèi)亞硝酸鹽含量測定

細胞在收獲前用冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)洗滌2次，4 000 r/min離心15 min(4 ℃);棄上清，沉淀用冰冷的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌2次，重復(fù)離心;所得沉淀溶解在200 μL PBS中，細胞懸液反復(fù)凍融3次，在冰浴中輕微超聲進行勻漿，4 000 r/min離心15 min(4 ℃).棄沉淀，上清液用于測定細胞內(nèi)的亞硝酸鹽含量.

1.7細胞凋亡檢測

通過熒光染料Hoechst33342進行細胞凋亡的檢測[14].藥物作用后的細胞，每孔加入1 mL 5 μg/mL的Hoechst33342溶液，在室溫下避光負載30 min.洗去多余的熒光染料，Petri培養(yǎng)皿置于倒置熒光顯微鏡的載物臺上觀察，用紫外光激發(fā)觀測，用電荷耦合元件(CCD)系統(tǒng)拍照.

1.8細胞內(nèi)蛋白質(zhì)硝化檢測

高濃度的糖以及hemin-nitrite-H2O2體系導(dǎo)致ECV304細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)硝化現(xiàn)象通過免疫印跡法(western blot)進行檢測.收獲10 cm培養(yǎng)皿中的細胞進行裂解，裂解后的細胞懸液離心處理后測其蛋白濃度.取80 μL已知蛋白濃度的細胞懸液，加入20 μL上樣緩沖溶液(5×)，混勻后置于沸水中煮3 min,然后按照保持各組上樣蛋白量一致的原則，取相應(yīng)量樣品放在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上進行電泳.電泳后，細胞蛋白被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用抗3-硝基酪氨酸(3-NT)多克隆抗體(稀釋倍數(shù)為1∶8 000)進行免疫印跡，之后,用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(稀釋倍數(shù)為1∶3 000)攪動孵育，用增強化學(xué)發(fā)光(ECL)法檢測3-NT水平.曝光時間視實驗效果而定.

1.9細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量測定

蛋白質(zhì)含量按Bradford法[15]測定，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn).

1.10數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié) 果

2.1高糖對細胞存活率的影響

終濃度為30和40 mmol/L的D-葡萄糖,可以顯著降低ECV304細胞活力(見圖1).對內(nèi)皮細胞，高濃度的糖作用72 h已經(jīng)可以造成糖尿病的體外模型[16].

2.2高糖對細胞內(nèi)GSH含量的影響

如圖2所示，終濃度為30和40 mmol/L的D-葡萄糖作用72 h后，細胞內(nèi)GSH的含量顯著減少，其最大減少量幾乎達到50%，并且呈劑量依賴趨勢.

**表示Plt;0.01，高糖Ⅰ組和Ⅱ組與對照組差異顯著圖1 高濃度的糖對細胞活力的影響

**表示Plt;0.01，高糖Ⅰ組和Ⅱ組與對照組差異顯著圖2 高濃度的糖對細胞內(nèi)GSH含量的影響

2.3高糖對亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的影響

如圖3所示，終濃度為30和40 mmol/L的D-葡萄糖作用72 h后,顯著增加了細胞內(nèi)亞硝酸鹽的含量，其增加量可以達到40%(見圖3(a))，培養(yǎng)基中硝酸鹽的含量則增加了25%(見圖3(b)).

2.4Hemin-nitrite-H2O2體系對細胞活力的影響

如圖4所示，在給定的濃度下，hemin-H2O2(H-GOx)體系可以顯著降低ECV304細胞的存活率，而一定濃度的亞硝酸鹽(Nitrite,0.75 mmol/L)則對細胞生長基本沒有影響.當(dāng)在hemin-H2O2體系中加入亞硝酸鹽后，hemin-nitrite-H2O2(H-N-GOx)體系對細胞的損傷加重，說明硝化反應(yīng)會進一步加重細胞損傷的程度.

2.5Hemin-nitrite-H2O2體系對細胞凋亡的影響

Hemin-nitrite-H2O2體系作用于細胞后，觀察到細胞核變形，部分細胞核碎裂成小塊，呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)(見圖5，箭頭所指)，證實hemin-nitrite-H2O2體系可以損傷細胞.

(a)亞硝酸鹽含量 (b)硝酸鹽含量**表示Plt;0.01，高糖Ⅰ組和Ⅱ組與對照組有極顯著差異圖3 高濃度的糖對細胞內(nèi)亞硝酸鹽和細胞外硝酸鹽含量的影響

**表示Plt;0.01，藥物作用組與對照組差異顯著#表示Plt;0.05，hemin-H2O2體系加入亞硝酸鹽前后差異顯著圖4 Hemin-nitrite-H2O2體系對細胞活力的影響

A：對照組；B：hemin-GOx作用；C：hemin-nitrite-GOx作用圖5 Hemin-nitrite-H2O2體系導(dǎo)致的細胞凋亡

2.6高糖及hemin-nitrite-H2O2體系對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)硝化的影響

高濃度的糖作用于ECV304細胞72 h后，Western blot顯示在細胞中原有的硝化蛋白條帶的強度增加，特別是分子量為 34，43和50 kD堿基對的細胞蛋白(見圖6(a)中條帶2和條帶3)，暗示高濃度的糖作用于細胞72 h后發(fā)生了明顯的蛋白質(zhì)硝化現(xiàn)象.

在hemin-nitrite-H2O2體系所導(dǎo)致的細胞蛋白質(zhì)硝化反應(yīng)中，除了原有的硝化條帶之外，還另外增加了分子量為11，17和20 kD堿基對的硝化條帶(見圖6(a)中條帶7)，并且原有的硝化條帶的強度也有所增加.

3 討 論

在糖尿病血管病變的發(fā)生和發(fā)展中，內(nèi)皮功能喪失及進一步的損傷發(fā)揮了重要的作用[17-19].體液中葡萄糖濃度的增加與糖尿病血管并發(fā)癥的

(a)SDS-PAGE電泳和Western blot檢測

(b)蛋白硝化相應(yīng)的光密度圖譜

(c)特定分子量蛋白硝化的光密度1：Blank；2：HG30；3：HG40；4：hemin；5：nitrite；6：hemin-GOx；7：hemin-nitrite-GOx**表示Plt;0.01，高糖和hemin-nitrite-H2O2體系作用后與對照組有極顯著差異圖6 高濃度的糖及hemin-nitrite-H2O2體系導(dǎo)致的細胞蛋白質(zhì)硝化

發(fā)生和發(fā)展緊密相關(guān).高濃度的糖可以在糖尿病病人體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致嚴重的內(nèi)皮功能喪失，主要包括降低細胞存活率[20]、打破抗氧化酶體系的平衡[21]及增加NO的釋放(亞硝酸鹽和硝酸鹽含量增大)[22]等.本研究發(fā)現(xiàn):高濃度的糖作用于ECV304細胞72 h后，可以降低細胞存活率(見圖1)、降低GSH含量(見圖2)、增加活性氮含量(見圖3).這些實驗結(jié)果表示:高濃度的糖作用于ECV304后可以產(chǎn)生氧化損傷.

高濃度的糖作用于內(nèi)皮細胞時會產(chǎn)生超氧陰離子(O2.-)，O2.-能夠結(jié)合NO，進而產(chǎn)生更強的氧化劑和硝化劑——過氧亞硝基陰離子(ONOO-)，ONOO-可以進一步導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化.已經(jīng)在高濃度的糖作用的內(nèi)皮細胞中發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)硝化現(xiàn)象[11,23].含有鐵卟啉的蛋白，如血紅素蛋白、肌紅蛋白、含鐵卟啉的酶，以及鐵卟啉本身，均可以催化NO-2/H2O2體系發(fā)生蛋白質(zhì)硝化反應(yīng)生成3-硝基酪氨酸(3-NT)[24]，這在生理病理條件下是較ONOO-更可能發(fā)生的反應(yīng).為了觀察高濃度的糖和外源性硝化試劑導(dǎo)致的蛋白質(zhì)硝化反應(yīng)之間的異同、硝化反應(yīng)對細胞存活率及凋亡的影響，本實驗以hemin-nitrite-H2O2體系作為外源性硝化試劑，觀察了它們對ECV304細胞的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):終濃度分別為30 mmol/L(見圖6(a)中條帶2)和40 mmol/L(見圖6(a)中條帶3)的D-葡萄糖作用于ECV304細胞72 h后，蛋白質(zhì)中硝化條帶的數(shù)量和強度都有所增加(尤其是分子量為34,43和50 kD堿基對的蛋白質(zhì)).由此推測，高濃度的糖作用于ECV304細胞后，先產(chǎn)生ONOO-，然后ONOO-再損傷蛋白質(zhì)發(fā)生酪氨酸硝化，且高濃度的糖引起的蛋白質(zhì)硝化對不同的蛋白質(zhì)有一定的選擇性.

從圖4和圖5可以發(fā)現(xiàn)，盡管外加的亞硝酸鹽在給定的濃度下對ECV304細胞無損傷，卻可以顯著加重hemin-H2O2體系對細胞的損傷程度.類似的現(xiàn)象在文獻[25]中也有報道.對這一現(xiàn)象唯一的解釋,就是在hemin-H2O2體系中加入亞硝酸鹽后發(fā)生了蛋白質(zhì)硝化反應(yīng)，加重了細胞損傷的程度.文獻[26]的報道與我們的推測類似，即:外加亞硝酸鹽后可以導(dǎo)致小鼠肝臟中酶活性進一步降低，而其原因可能就是肝臟蛋白發(fā)生了蛋白質(zhì)硝化反應(yīng).通過比較hemin-nitrite-H2O2體系和hemin-H2O2體系作用于ECV304細胞后的蛋白質(zhì)硝化現(xiàn)象，可以發(fā)現(xiàn):在分子量為11,17,20,66和80 kD堿基對的細胞蛋白中，hemin-nitrite-H2O2體系導(dǎo)致硝化的條帶強度大于hemin-H2O2體系(見圖6(a));同時,硝化條帶的增加更為明顯(11,17和20 kD堿基對)，說明蛋白質(zhì)硝化反應(yīng)可以導(dǎo)致細胞進一步損傷[25].無論外源性試劑還是高濃度的糖所導(dǎo)致的蛋白質(zhì)硝化條帶在分子量為90～170 kD堿基對的強度都有所降低，對于該現(xiàn)象，還需要對其機理做進一步的研究.

4 結(jié) 論

通過本研究可以推出如下結(jié)論：(1)高濃度的糖可以劑量依賴性地導(dǎo)致ECV304細胞產(chǎn)生損傷，主要包括：降低細胞存活率、降低GSH含量、增加活性氮含量(細胞內(nèi)亞硝酸鹽含量及培養(yǎng)基中硝酸鹽含量),以及蛋白質(zhì)硝化現(xiàn)象發(fā)生；(2)蛋白質(zhì)硝化可以進一步加重細胞損傷；(3)對某些蛋白質(zhì)來說，高濃度的糖所導(dǎo)致的蛋白質(zhì)硝化現(xiàn)象同其他外源性硝化試劑(如hemin-nitrite-H2O2體系)所導(dǎo)致的蛋白質(zhì)硝化相類似，不同之處在于:外源性硝化試劑所導(dǎo)致的蛋白質(zhì)硝化主要發(fā)生在小分子量蛋白質(zhì)上(11,17和20 kD堿基對).通過對比高濃度的糖及外源性硝化劑所導(dǎo)致的蛋白質(zhì)硝化，可以推測:在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展中，蛋白質(zhì)硝化反應(yīng)參與了損傷過程，并且蛋白質(zhì)中的酪氨酸會有選擇地發(fā)生硝化反應(yīng).

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(責(zé)任編輯 薛 榮)

Highglucoseandexogenousnitratingagentsinducedhumanumbilicalveinendothelialcellinjury:involvementofproteintyrosinenitration

ZHAO Yuling1, LU Naihao2, GAO Zhonghong2

(1.CollegeofChemistryandLifeScience,ZhejiangNormalUniversity,JinhuaZhejiang321004,China; 2.DepatmentofChemistryandChemicalEngineering,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,WuhanHubei430074,China)

Oxidative and nitrative injury in human umbilical vein endothelial cells (ECV304) induced by high glucose and exogenous nitrating agent were detected by cell biological and chemical methods. It was found that high glucose (30 mmol/L and 40 mmol/L) stimulated ECV304 injury in a dose-dependent manner, including reducing cell viability, decreasing glutathione (GSH) content, increasing the production of nitric oxygen (NO) (increased nitrite content in cell and nitrate content in medium) and generating protein tyrosine nitration. It was also found that protein tyrosine nitration could induce cell injury further. Tyrosine nitration induced by high glucose was different from extrinsic factors. It could be speculated that protein was nitrated selectively to generate nitrotyrosine in diabetic vascular complications.

diabetic vascular complications; high glucose; exogenous nitrating agent; protein nitrotyrosine; endothelial cells

1001-5051(2010)01-0082-07

2009-07-02

浙江師范大學(xué)博士科研啟動基金資助項目(ZC304009077)；浙江師范大學(xué)校級青年基金資助項目(KYJ06Y09040)

趙玉玲(1977-)，女，河南南陽人，講師，博士.研究方向：生物無機化學(xué).

R363.2+1

A