華北煤炭醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)系(唐山063000)

賈永森 司富春* 呂翠田* 王媛媛Δ

近年來食管癌的臨床和實(shí)驗(yàn)研究大都著眼于分子生物學(xué)上、下游技術(shù)檢測(cè)癌細(xì)胞本身分子水平含量的變化或者藥效對(duì)其干預(yù)作用,而有關(guān)體外干預(yù)食管癌細(xì)胞增殖機(jī)制的研究尚不多見。

表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor,EGF)是體外最強(qiáng)的促表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子之一,由 Stanley Cohen在小鼠頜下腺分離純化(m EGF),隨后發(fā)現(xiàn)人胃酸分泌抑制因子(Urogastrone,UG)即人表皮生長(zhǎng)因子(h EGF)主要在頜下腺合成。實(shí)驗(yàn)證明,當(dāng)有 EGF持續(xù)存在時(shí),細(xì)胞呈多層性生長(zhǎng),其密度可達(dá)對(duì)照組的4～6倍[1]。本研究觀察了h EGF對(duì)高分化食管鱗癌細(xì)胞株 EC9706增殖的影響。

材料與方法

1 材 料 人食管癌細(xì)胞株 EC9706由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);人表皮生長(zhǎng)因子(h EGF)(sigma公司);RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO公司);小牛血清(BCS)(GIBCO公司);胰蛋白酶(華美公司);MTT(Amresco公司);DMSO(Amresco公司);RNase A(sigma公司);碘化丙啶(PI)(sigma公司)

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng):從液氮中取出凍存的EC9706細(xì)胞,37℃水浴使之解凍。吸出細(xì)胞懸液,移入離心管中,補(bǔ)加 10ml RPMI 1640培養(yǎng)液,吹打、混勻,1000rpm×10min離心,棄上清,加入含 10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液 10ml,吹打混勻后接種于Φ100mm培養(yǎng)皿中,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每 2～3天傳代1次。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)

2.2.1 量效關(guān)系:5×104個(gè)/0.5ml細(xì)胞懸液,接種于24孔平面培養(yǎng)板中,500μl/孔。置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,細(xì)胞貼壁 24h后,棄上清,以不含血清培養(yǎng)液清洗各孔貼壁細(xì)胞中殘留血清成分,600μl/孔,重復(fù)1次。加入不含血清培養(yǎng)液 500μl/孔,饑餓細(xì)胞 24h,棄舊培養(yǎng)液,以不含血清 RPMI1640培養(yǎng)液配制不同濃度 hEGF工作液:400ng/ml,200ng/ml,100ng/ml,50ng/ml,25ng/ml,12.5ng/ml 6個(gè)梯度,每組 3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)對(duì)應(yīng) 2個(gè)復(fù)孔加入不含血清培養(yǎng)液,做空白平行對(duì)照,500μl/孔。繼續(xù)培養(yǎng) 24h后,吸去上清液,MTT法測(cè)定光吸收值(OD值),實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。按照公式:

h EGF刺激 EC9706細(xì)胞增殖率=(hEGF組 OD值 /對(duì)照組 OD值-1)×100%繪制量效關(guān)系曲線圖,確定hEGF最高刺激增殖濃度。

2.2.2 時(shí)效關(guān)系:細(xì)胞培養(yǎng)同 2.2.1,以不含血清培養(yǎng)液配制h EGF最高刺激細(xì)胞增殖濃度,加入24孔板 3～6列共 16個(gè)復(fù)孔中作為h EGF組,1～2列 8個(gè)復(fù)孔加入不含血清培養(yǎng)液作為空白對(duì)照平行復(fù)孔,分別于12h、24h、36h、48h測(cè)定第 1、2、3、4行OD值,方法同 2.2.1。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

繪制時(shí)效關(guān)系曲線圖,觀察h EGF刺激細(xì)胞增殖與時(shí)間的關(guān)系。

2.3 鏡下觀察hEGF對(duì)人食管癌 EC9706細(xì)胞增殖和形態(tài)的影響:以 1×106個(gè)細(xì)胞 /皿的密度接種EC9706細(xì)胞于Φ100mm培養(yǎng)皿中,10ml/皿,于37℃,5%CO2,飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24h,棄舊培養(yǎng)液,加入不含血清培養(yǎng)液 10ml/皿,饑餓細(xì)胞 24h,加入h EGF(最高刺激濃度),空白對(duì)照組加不含小牛血清的培養(yǎng)液 10ml/皿,入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),分別于12h、24h、36h在倒置顯微鏡下觀察空白對(duì)照組和hEGF組的EC9706細(xì)胞增殖情況和形態(tài)學(xué)變化。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析h EGF對(duì) EC9706細(xì)胞周期的影響:以 1×106個(gè)細(xì)胞 /皿的密度接種 EC9706細(xì)胞于Φ100mm培養(yǎng)皿中,10ml/皿,共 4皿。于37℃,5%CO2,飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24h,棄舊培養(yǎng)液,加入不含血清培養(yǎng)液 10ml/皿,饑餓細(xì)胞 24h,3皿加入含h EGF(最高刺激濃度)無(wú)血清培養(yǎng)液,1皿空白對(duì)照加入無(wú)小牛血清的培養(yǎng)液,10ml/皿,均入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。hEGF組三皿分別在 12h、24h、36h時(shí)間點(diǎn)收集,空白無(wú)血清對(duì)照組在 24h時(shí)間點(diǎn)收集。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)以3ml/皿 Trypsin消化,并收集入15ml離心管中,1000rpm×10min離心,棄上清液,加入PBS 2ml,重懸細(xì)胞,1000rpm×5min離心,重復(fù) 1次。棄掉 PBS,加入PBS 100μl以微量移液器吹打混勻,避免氣泡產(chǎn)生,加入70%乙醇固定細(xì)胞,放入4℃過夜。待 4管細(xì)胞均收集完畢,將固定細(xì)胞以 200g×5min離心,棄掉乙醇,并在 3ml預(yù)冷的PBS中重懸細(xì)胞,靜息 1min,200g×5min,重復(fù) 1次。棄掉 PBS,依次加入PBS 850μl,10mg/ml RNase A 10μl,1% TritonX-100 100μl,1mg/ml PI 40μl,37℃下避光孵育5min。用400目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀用Cellquest Pro進(jìn)行細(xì)胞周期分析,并用Modfit LT細(xì)胞周期分析軟件分析結(jié)果,得出不同組別細(xì)胞在各細(xì)胞周期的百分比率。

結(jié) 果

1 h EGF對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞增殖刺激的量效關(guān)系,見表1、圖1。

表1 不同濃度 EGF對(duì) EC9706細(xì)胞增殖的影響(MTT法)(±sD)

表1 不同濃度 EGF對(duì) EC9706細(xì)胞增殖的影響(MTT法)(±sD)

增殖率比較:與200ng/ml濃度時(shí)相比,* :P＜0.01;Δ:P＜0.05

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圖1 不同濃度 EGF對(duì) EC9706細(xì)胞增殖影響的關(guān)系

從表1和圖1可以看出,12.5ng/ml到 400ng/ml 6個(gè)梯度濃度的細(xì)胞培養(yǎng) 24h,細(xì)胞生長(zhǎng) OD值總體隨著濃度的升高而增加,提示細(xì)胞數(shù)目增多,在 200ng/ml濃度時(shí),OD值達(dá)峰值,與空白對(duì)照孔細(xì)胞相比,增殖率為51.8%,到 400ng/ml濃度時(shí),增殖率下降,提示細(xì)胞增殖飽和。組間增殖率比較,在200ng/ml濃度時(shí),增殖率與其他濃度時(shí)相比,分別提示顯著性差異(P＜0.05)和極顯著性差異(P＜0.01),提示此濃度時(shí) h EGF對(duì) EC9706細(xì)胞刺激作用最明顯。

2hEGF對(duì)人食管癌 EC9706細(xì)胞增殖刺激的時(shí)效關(guān)系,見表2、圖2。

圖2 h EGF(200ng/ml)對(duì) EC9706細(xì)胞增殖影響時(shí)效關(guān)系

表2 不同時(shí)間h EGF(200ng/ml)對(duì) EC9706細(xì)胞增殖的影響(MTT法)(±sD)

表2 不同時(shí)間h EGF(200ng/ml)對(duì) EC9706細(xì)胞增殖的影響(MTT法)(±sD)

增殖率比較:與24h時(shí)間點(diǎn)相比,* :P＜0.01;Δ:P＜0.05

24 1.696±0.131 2.651±0.112 56.3±1.9 36 1.327±0.098 1.857±0.057 40.1±1.5Δ 48 0.916±0.102 1.062±0.063 16.0±2.3*

從表2和圖2可以看出,以同一h EGF濃度 200ng/ml作用的EC9706細(xì)胞在 12h與空白對(duì)照組相比即有小幅度的增殖,增殖率為18.9%;在此后一直到24h,可以看出細(xì)胞增殖呈大幅度上升,到 24h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值 56.3%,兩時(shí)間點(diǎn)比較具有極顯著性差異(P＜0.01);此后的36h、48h,細(xì)胞增殖呈顯著下降趨勢(shì),分別與24h時(shí)間點(diǎn)比較,具有顯著性差異(P＜0.05)和極顯著性差異(P＜0.01)。提示在 24h時(shí)間點(diǎn),hEGF對(duì)EC9706細(xì)胞的刺激作用最強(qiáng)。

3 h EGF對(duì)人食管癌 EC9706細(xì)胞增殖和形態(tài)的影響,見圖3。

圖3 h EGF對(duì) EC9706細(xì)胞增殖和形態(tài)的影響

在倒置顯微鏡下觀察,空白無(wú)血清對(duì)照組細(xì)胞呈扁平多角形,具有典型的上皮型細(xì)胞生長(zhǎng)特性,隨饑餓時(shí)間延長(zhǎng),逐漸有細(xì)胞形態(tài)變圓、并有透亮區(qū),呈脫壁狀態(tài)。12h EGF組鏡下觀察可見EGF(200ng/ml)組細(xì)胞密度高于空白對(duì)照組,細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形改變,有較長(zhǎng)突起,互相連接成網(wǎng)狀,細(xì)胞之間連接不甚緊密,24h細(xì)胞連接緊密,數(shù)目明顯多于12h EGF組,均呈貼壁生長(zhǎng),繼續(xù)呈長(zhǎng)梭形改變,36h EGF組可見貼壁細(xì)胞有少量呈圓形改變,細(xì)胞周緣有透亮區(qū),逐漸有細(xì)胞脫壁,細(xì)胞數(shù)目顯著減少,鏡下單個(gè)細(xì)胞呈透亮狀態(tài)。

表3 h EGF刺激的EC9706細(xì)胞周期分布(%)(±sD)

表3 h EGF刺激的EC9706細(xì)胞周期分布(%)(±sD)

S+G2 M期細(xì)胞百分率比較:與24h時(shí)間點(diǎn)相比,* P＜0.01;Δ P＜0.05

h EGF(36h)60.10±1.02 15.62±1.53 24.29±2.58 39.66±1.73Δ

4 h EGF對(duì)人食管癌 EC9706細(xì)胞周期的影響:從四組的細(xì)胞周期 FCM分析結(jié)果來看(表3),h EGF三組細(xì)胞 S+G2 M期細(xì)胞比率均明顯高于空白對(duì)照無(wú)血清組,細(xì)胞周期中 S+G2M期的比例反映了細(xì)胞群體中細(xì)胞增殖的程度,24h收集的h EGF刺激細(xì)胞 S期比率較之空白對(duì)照和h EGF12h、36h顯著升高。從S+G2 M期分析,24h的hEGF組與空白對(duì)照相比,百分率增高 47%以上,這與MTT檢測(cè)結(jié)果一致。24h時(shí)間點(diǎn)與其他三個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較,具有顯著性差異(P＜0.05),提示 24h時(shí)hEGF促進(jìn)細(xì)胞過渡到增殖周期的數(shù)目達(dá)到峰值。

討 論

EGF是體外最強(qiáng)的促表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子之一,能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基磷酸化水平增高,提高細(xì)胞內(nèi)代謝水平。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中,EGF作為一種重要的絲裂原,與其受體結(jié)合后可激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及分化[2]。近年的研究表明,EGF與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密不可分。

我們以 24孔板種植細(xì)胞,MTT法檢測(cè)了細(xì)胞增殖情況。在較低濃度時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,推測(cè)由于EGF濃度較低,各細(xì)胞之間膜表面受體 EGFR出現(xiàn)受體競(jìng)爭(zhēng)性抑制;當(dāng)濃度達(dá)到 200ng/ml時(shí),細(xì)胞增殖率達(dá)到 51.8%,提示此濃度的h EGF能刺激細(xì)胞較明顯的增殖。

EGF作為有絲分裂源性生長(zhǎng)因子,對(duì)腫瘤細(xì)胞的形態(tài)影響非常明顯,可以看到細(xì)胞在被刺激 12h后為長(zhǎng)梭型改變,并伸出觸角狀細(xì)胞突起,呈現(xiàn)遷移能力的增強(qiáng)。在24h時(shí)EGF對(duì)細(xì)胞刺激增殖能力最強(qiáng),此時(shí)細(xì)胞遷移能力活躍,細(xì)胞以減弱細(xì)胞貼壁狀態(tài)來完成增殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,細(xì)胞繼續(xù)呈長(zhǎng)梭形改變,有較長(zhǎng)突起。細(xì)胞由扁平的多角形上皮型細(xì)胞轉(zhuǎn)變成長(zhǎng)梭形,這種細(xì)胞形態(tài)的轉(zhuǎn)變,即上皮細(xì)胞-間葉樣變(Epithelialmesenchymal transition,EMT),可以視為細(xì)胞侵襲的一種標(biāo)志,有利于腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[3]。

細(xì)胞周期(Cell cycle)是指親代細(xì)胞分裂結(jié)束到子細(xì)胞分裂結(jié)束之間的間隔時(shí)期。一個(gè)典型的細(xì)胞周期有 4個(gè)期即 G1-S-G2-M構(gòu)成,并受到胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)途徑及反饋環(huán)路的調(diào)控。細(xì)胞周期調(diào)控異常是癌變的重要機(jī)制。惡性腫瘤細(xì)胞的周期調(diào)控失控,使細(xì)胞分化受阻,處于過度增殖狀態(tài)[4]。細(xì)胞周期中S+G2M期的比例反映了腫瘤細(xì)胞群體中處于增殖階段的數(shù)量,從一定程度上代表了細(xì)胞增殖狀態(tài)[5]。我們以 200ng/ml濃度觀察了hEGF刺激的EC9706細(xì)胞周期的變化。以流式細(xì)胞儀分析了空白對(duì)照、EGF(12h)、EGF(24h)、EGF(36h)的細(xì)胞周期變化:EGF刺激細(xì)胞 12h后,S+G2M期細(xì)胞比率比空白對(duì)照高出 6.9%,到 24h時(shí),S+G2M期增高 47%,其中 S期在達(dá)到 30%,提示hEGF刺激細(xì)胞由 G1期過渡到 S期,36h時(shí),S期、G2M期以及S+G2 M期均比24h明顯下降,提示h EGF刺激細(xì)胞增殖在24h達(dá)峰值。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,hEGF能夠刺激 EC9706細(xì)胞由生長(zhǎng)抑制的G1期過渡到 S期,從而達(dá)到促增殖作用。有關(guān)h EGF通過何途徑引起細(xì)胞的增殖,是否涉及到蛋白質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制?我們將進(jìn)行更深入的研究。

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