咸寧學(xué)院臨床學(xué)院(咸寧437100)

李偉民 傅祖植*

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥 (Postmenopausol osteoporosis,PMOP)的發(fā)病機(jī)制目前還不十分清楚,晚近研究報(bào)道,除雌激素水平下降外,增齡和絕經(jīng)可引起糖代謝紊亂,體內(nèi)晚期糖化終末產(chǎn)物(Advanced glycosylation end products,AGEs)在體內(nèi)積累增多,高水平的AGEs可使成骨細(xì)胞的數(shù)量和活性降低,骨形成減少。而 AGEs特異性抑制劑胍乙酸(Glycocyamine)則可能具有降低 AGEs,啟動(dòng)成骨細(xì)胞從而增加骨形成的作用[1]。國(guó)內(nèi)少見此類報(bào)道,本研究以去勢(shì)大鼠建立的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型,給予胍乙酸溶液治療,觀測(cè)其對(duì)骨形成指標(biāo)的作用。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 54只3月齡雌性Sprague-dawly大鼠,武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體質(zhì)量 210±18g,隨機(jī)分為3組,每組 18只。胍乙酸組(groups 1,G1):去勢(shì)后給予1%胍乙酸水溶液,自由飲用;去勢(shì)組(groups 2,G2):行輸卵管峽部結(jié)扎后切除雙側(cè)卵巢;假去勢(shì)組(groups 3,G3):單純開腹假去勢(shì)。術(shù)后第 4、10和16周定為實(shí)驗(yàn)周。各組再按各實(shí)驗(yàn)周分為3個(gè)亞組(每組 6只)。

2 方 法

2.1 給藥方法:各亞組動(dòng)物分籠,標(biāo)準(zhǔn)固體飼料和雙蒸水(實(shí)驗(yàn)組給予胍乙酸液)自由攝食喂養(yǎng),光照12h,黑暗 12h。室溫為(25±2)℃。實(shí)驗(yàn)組按 1‰濃度胍乙酸水溶液(深圳 genzyme晶美公司產(chǎn)品)浸兌,自由飲用。于去勢(shì)手術(shù)次日開始給藥,療程分別為4W、10w和16w。

2.2 標(biāo)本的收集和處理

2.2.1 血和骨標(biāo)本的收集:分別于每實(shí)驗(yàn)周獲取標(biāo)本前14d和前4d各鼠皮下注射1%四環(huán)素500mg/kg雙重標(biāo)記。處死前稱量體重,右心室采血,離心分離血清,-70℃凍存?zhèn)溆?取左側(cè)脛骨下端 3g,置于預(yù)冷的70%乙醇中,4℃冰箱固定,作骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析;無菌分離各鼠右側(cè)脛骨下端 4g,Hant’S液反復(fù)沖洗,用骨鉗將其分離為1mm3碎塊,置于3ml RPMI1840培養(yǎng)液的12孔培養(yǎng)板,37℃,100%濕度,φ=5% CO2培養(yǎng)箱中 48h。吸取培養(yǎng)液離心后取上清液,置-20℃保存?zhèn)渥龉?AGEs測(cè)定。

2.2.2 骨切片的制備[2]:左脛骨標(biāo)本依次梯度乙醇脫水,丙酮脫酯,二甲苯透明 24h后用甲基丙烯酸甲酯包埋;電動(dòng) Jung① K型切片機(jī)(德國(guó))制備 7μm和10μm的切片,薄片分別做甲苯胺藍(lán)和Von Kossa染色,用于計(jì)量學(xué)靜態(tài)指標(biāo)測(cè)定;厚片不染色,在熒光顯微鏡下做動(dòng)態(tài)指標(biāo)測(cè)定。脫去包埋劑,中性樹脂封片。

2.2.3 尿標(biāo)本的收集:術(shù)后各實(shí)驗(yàn)周常喂養(yǎng)后,于處死前 24h代謝籠收集尿液 2ml,4℃,2000r/min,留取上清液,儲(chǔ)存于-70℃至同一批。備作尿吡啶醚(PYD)和脫氧吡啶醚(DYD)測(cè)定。

2.3 測(cè)定標(biāo)準(zhǔn):骨形成指標(biāo)骨鈣素(BGP)和骨特異性堿性磷酸酶(骨 AKP),檢測(cè)藥盒由美國(guó) Metra Biosystems Inc提供(ELISA),批內(nèi)變異＜5%,批間變異＜9%。反映骨吸收指標(biāo):尿吡啶醚(PYD)和脫氧吡啶醚(DYD)測(cè)定,用 RP-HPLC法[3]。觀測(cè)骨形態(tài)計(jì)量學(xué)用IBAS計(jì)算機(jī)全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)(中山大學(xué)生理學(xué)圖像分析室提供),德國(guó) KONTRON IBA 2.0全自動(dòng)分析系統(tǒng),包括 Varico Cam冷水圖像輸入儀,ZELSS Axiatron研究顯微鏡(中山大學(xué)生理室)和EMAIL-200病理圖像分析儀(廣東億鳴科技術(shù)公司提供),不脫鈣骨組織切片 [7μm在顯微鏡下,10μm厚片在熒光顯微鏡下(×200,360波長(zhǎng))],每張切片在骨生長(zhǎng)線下1mm的范圍,選擇2～3個(gè)視野,求得下述參數(shù):骨小梁體積比(TBV,%),骨小梁平均厚度(MTT,μm),骨形成表面(FS%),骨吸收表面(RS,%),四環(huán)素標(biāo)記面積百分比(TLS%)和骨礦化沉積速率(MAP,μm/d)。骨培養(yǎng)上清液以膠原中羥脯氨酸的含量為14%,計(jì)算出骨膠原含量。AGEs含量以每毫克膠原中相對(duì)熒光強(qiáng)度表示 RU/mg膠原)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示,各組間比較用方差分析,相關(guān)分析用直線相關(guān)分析,以 SPSS 11.5完成所有統(tǒng)計(jì)學(xué)工作。

結(jié) 果

1 各組膠原中 AGEs及骨形成、骨吸收指標(biāo)變化:見表1。結(jié)果顯示,去勢(shì)后 AGEs含量明顯升高,與假去勢(shì)組比較有顯著差異(P＜0.01)。經(jīng)胍乙酸治療后骨膠原中 AGEs明顯降低,與去勢(shì)組比較有顯著差異(P＜0.01)。骨吸收指標(biāo)尿PYD和DPD在胍乙酸組與單純?nèi)?shì)組比較均無明顯差異(P＜0.05),但較假去勢(shì)組明顯升高(P＜0.05)。骨形成指標(biāo) BGP和骨AKP在胍乙酸組明顯高于去勢(shì)組(分別為P＜0.01和P＜0.05)。

2 胍乙酸組和去勢(shì)組4～16w骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)變化比較:見表2。FS、TBV、M TT在去勢(shì)后第 4周,胍乙酸組明顯高于去勢(shì)組,這種差異在第 10周表現(xiàn)最為顯著。尤其是 TBV和FS(分別為P＜0.001和P＜0.01)。隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)(去勢(shì)后第16周)MAR逐漸增加(P＜0.001)。而 RS隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng),雖有逐漸減少的趨勢(shì),但無顯著性,且與去勢(shì)組比較差異不明顯。TLS在 4～16w胍乙酸組與去勢(shì)組比較差異無顯著性。

表1 三組骨膠原中 AGEs含量和骨吸收骨形成生化指標(biāo)比較(±s)

表1 三組骨膠原中 AGEs含量和骨吸收骨形成生化指標(biāo)比較(±s)

注:與假去勢(shì)組比較:*P＜0.05;與去勢(shì)組比較:△P＜0.01;#P＜0.05

去勢(shì) 組 58.96±3.13 120.9±6.83 31.9±1.48 4.17±0.82 20.17±6.37假去勢(shì)組 52.83±5.46 103.2±3.26 25.7±1.25 5.37±1.44 21.28±7.36

表2 去勢(shì)后第4～16w骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)動(dòng)態(tài)對(duì)照(±s)

表2 去勢(shì)后第4～16w骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)動(dòng)態(tài)對(duì)照(±s)

注:與去勢(shì)組比較*P＜0.05;△P＜0.01

RS(%)5.95±1.10 6.12±0.51 5.56±1.38 6.07±1.00 5.49±1.27 6.03±1.25 TBV(%)41.6±2.20* 33.86±2.71 51.73±4.29* 39.14±1.59 53.18±2.23△ 42.37±0.12 M TT(μm) 79.14±1.98* 70.00±2.10 87.21±0.50* 82.33±1.58 96.42±6.30* 91.74±3.60 TLS(%)19.07±3.70 17.5±1.80 19.83±0.18 17.94±2.31 20.15±0.14 18.56±1.70 M AR(μm/d)0.82±0.15 0.78±0.14 0.93±0.08* 0.81±0.09 0.94±0.17* 084.±0.11

3 第 10周各組骨形態(tài)改變:去勢(shì)后第10周可見脛骨骺板下區(qū)骨小梁大片消失,髓腔內(nèi)殘留紐扣樣或棒狀骨小梁結(jié)構(gòu);排列疏松。給胍乙酸后第 10周可見脛骨骺板下區(qū)骨小梁結(jié)構(gòu)連接較緊;排列有規(guī)則,小梁間相互呈網(wǎng)狀,骨小梁各壁厚度較為一致。

討 論

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性骨量減少及骨組織結(jié)構(gòu)改變伴有骨脆性增加并易導(dǎo)致骨折的老年性疾病。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生由于骨形成減少,骨吸收超過了骨形成所致。目前的治療藥物,如雌激素,二膦酸鹽及降鈣素等多系抑制破骨細(xì)胞的吸收作用以減少骨丟失。而對(duì)促進(jìn)骨形成作用的藥物則研究和應(yīng)用較少[1]。Gaspard等[5]提出,絕經(jīng)后雌激素降低和增齡,使機(jī)體易發(fā)生胰島素抵抗,引起糖代謝紊亂(此時(shí) AGEs產(chǎn)生增多),高濃度的AGEs阻礙成骨細(xì)胞對(duì)骨基質(zhì)蛋白和骨膠原蛋白的粘附,并抑制成骨細(xì)胞分化,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。胍乙酸是一種親核肼類化合物,主要與早期糖基化反應(yīng)中間產(chǎn)物 3-脫氧葡萄糖酮醛(3-deoxyglucosome)反應(yīng),使其不能生成終產(chǎn)物 AGEs,并增加成骨細(xì)胞對(duì)骨膠原蛋白粘附,啟動(dòng)成骨作用,增加骨形成。

本研究發(fā)現(xiàn)去勢(shì)后大鼠骨膠原中 AGEs明顯升高,經(jīng)胍乙酸治療后 AGEs顯著減少,骨形成指標(biāo)上升。提示胍乙酸溶液能明顯增加成骨作用,BGP、骨AKP等靜態(tài)指標(biāo)較去勢(shì)組和假去勢(shì)組均有增高;而反映骨吸收作用的指標(biāo):尿 PYD和DYD,與假去勢(shì)組比較胍乙酸組雖有促進(jìn)作用(P＜0.05),但相對(duì)去勢(shì)組抑制骨吸收作用差異不明顯。反映骨吸收的骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)在給藥后 4～16w均較去勢(shì)組有下降趨勢(shì),但無顯著性。這些結(jié)果均提示胍乙酸溶液也可抑制骨吸收,但相對(duì)促進(jìn)骨形成而言作用不明顯,且我們認(rèn)為這種作用是在一定藥物濃度基礎(chǔ)上持續(xù)緩慢進(jìn)行的。這一點(diǎn)與Munch等[6]報(bào)道一致,胍乙酸溶液可刺激骨髓成骨細(xì)胞,促進(jìn)新骨形成,同樣也可刺激破骨細(xì)胞骨吸收減少和骨重建加強(qiáng)。

骨形態(tài)計(jì)量學(xué)方面的動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),給藥后第 4周骨形成指標(biāo) FS、TBV、MTT與去勢(shì)組比較有明顯升高(P＜0.05),而 M AP至第 10周也明顯升高,說明給予胍乙酸液早期就有骨形成作用,而這種作用至第 10周最為明顯。FS(P＜0.01)、TBV(P＜0.001)。所有實(shí)驗(yàn)周(4～16w)胍乙酸對(duì) TLS的改變作用略有升高(P＜0.05)。胍乙酸對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠的骨代謝影響是明顯促進(jìn)成骨作用。尤其反映在骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)中的骨形成指標(biāo)都明顯增高,說明給藥后使成骨細(xì)胞活躍增生,骨礦化和類骨質(zhì)增多,骨量丟失相對(duì)減少[7]。

綜上,本研究表明,胍乙酸溶液對(duì)去勢(shì)后骨質(zhì)疏松大鼠刺激骨形成作用大于抑制骨吸收作用,使二者骨代謝耦聯(lián)趨于平衡。骨量丟失減少。繼續(xù)這方面的研究,可能會(huì)對(duì)臨床上防治骨質(zhì)疏松癥的用藥開辟新的途徑。

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