鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院腫瘤中心(十堰442000)

鄧守恒 曾小華* 曹鳳軍 類健翔 鄧守明# 陳 萍

急性早幼粒細(xì)胞性白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)是急性白血病中的一種。臨床上,維甲酸(Retinoic acid,RA)作為誘導(dǎo)分化劑可使大多數(shù)APL患者取得完全緩解,但會(huì)引起維甲酸相關(guān)綜合征及存在著嚴(yán)重的耐藥性,相當(dāng)數(shù)量的APL患者在完全緩解后短期內(nèi)復(fù)發(fā)。三氧化二砷可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡治療 APL,但低劑量的三氧化二砷無法誘導(dǎo) RA耐藥的APL細(xì)胞分化或凋亡,而高劑量的砷及其化合物又可誘導(dǎo)多種不良反應(yīng)使病人不能耐受[1]?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上和砷屬同族的硒是人和動(dòng)物體內(nèi)必需的微量元素之一,具有顯著的防癌和抗癌作用。硒化殼聚糖[2]是利用亞硒酸和低分子殼聚糖通過拼合原理制備成的一種有機(jī)硒,理論上應(yīng)該有抗 APL作用,且毒副作用應(yīng)該比無機(jī)硒和砷小得多。本實(shí)驗(yàn)觀察了硒化殼聚糖對(duì)體外培養(yǎng)的NB4細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用并探討了這種作用與細(xì)胞端粒酶活性和人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,h TERT)基因表達(dá)的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)告如下。

材料和方法

1 藥品試劑儀器 硒化殼聚糖(批號(hào):100601-200518)由福建醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)系合成,經(jīng)福建省分析測(cè)試中心檢測(cè),含硒量為0.4%,用培養(yǎng)液配成800mg/L的溶液待用;TRAPeze ELISA端粒酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自intergen公司;Trizol總RNA抽提試劑盒、Revert AidTMfirst strand cDNA synthesis kit為Fermentas產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自丹麥Nunclon公司;DG-3022型酶標(biāo)儀(中國(guó)南京);AM-PLITRONⅡ型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó) Barnscread/Thermolyme公司)。

2 細(xì)胞及培養(yǎng) 人急性早幼粒細(xì)胞性白血病NB4細(xì)胞引自福建省血液病研究所,培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)為10%新生牛血清,100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素和2U/ml谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi),于37℃、飽和濕度,5%CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞接種24h后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期。

3 MTT法檢測(cè)硒化殼聚糖對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 在96孔培養(yǎng)板上接種處于指數(shù)生長(zhǎng)期的NB4細(xì)胞,每孔加細(xì)胞懸液 100Ul,接種量 5×104/ml。實(shí)驗(yàn)孔加入等體積、不同濃度的硒化殼聚糖,對(duì)照孔加入等體積溶劑,設(shè)4個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板放至37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至所需時(shí)間,加入MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng) 4h后,離心,棄上清,加入二甲基亞砜(DMSO),顆粒完全溶解后用酶標(biāo)儀在 550nm處測(cè)定每孔的光密度值,重復(fù)3次。生長(zhǎng)抑制率=(空白組光密度-實(shí)驗(yàn)組光密度)/空白組光密度×100%

4 端粒酶活性檢測(cè)[3]分別收集不同濃度硒化殼聚糖作用 48h后的NB4細(xì)胞各 2×105個(gè),PBS洗 2次,采用 TRAPPCR-ELISA法,在酶標(biāo)儀上 450nm和690nm處測(cè)定A值,設(shè)未加藥組為對(duì)照,結(jié)果△A值=A450-A690,△A值＜0.2為陰性,△A值＞0.8為陽性。

5 RT-PCR法檢測(cè) NB4細(xì)胞h TERT mRNA的水平 收集各組細(xì)胞各 3～5×106個(gè),加1ml Trizol,按說明提取細(xì)胞總RNA,要求能夠顯示出清晰的28s及18s兩條rRNA帶,取細(xì)胞總 RNA 1μg,小鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus,M-MLV)200U,二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)0.2μmol/L,RNA酶抑制劑(RNase inhibitor,RNasin)20U,四種脫氧核糖核苷酸混合物(d NTP)20nmol/L,隨機(jī)引物100ng,總反應(yīng)體系為20μl,42℃反應(yīng) 1h,70℃10min中止反應(yīng)。取合成的cDNA模板 2μl,上下游引物各15pmol/L,Taq酶1U,d NTP5nmol/L用于PCR,94℃30s,58℃45s,72℃60s,35個(gè)循環(huán),最后72℃5min,取PCR產(chǎn)物各 10μl,在含0.5μg/ml溴化乙錠的2%瓊脂搪凝膠中進(jìn)行電泳,紫外反射儀上觀察、拍照。引物由上海sangon合成,hTERT;5’-CCGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3';5'-GGATGA AGCGGACTCTGGA-3',擴(kuò)增片段為145bp,β-actin:5'-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3';5'-ATGTCACGCACGATTTCCCGC-3',擴(kuò)增片段為501 bp。

結(jié) 果

1 硒化殼聚糖對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用,見圖1。MTT法檢測(cè)顯示,25～200mg/L的硒化殼聚糖對(duì)體外培養(yǎng)的NB4細(xì)胞生長(zhǎng)均具有抑制作用,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物劑量的增加,抑制作用逐漸增強(qiáng),呈現(xiàn)出明顯的時(shí)效和量效關(guān)系。

2 硒化殼聚糖對(duì)NB4細(xì)胞端粒酶活性影響結(jié)果,見附表。從表中可見,未加藥物組細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性較高,經(jīng) 50 mg/L及以上濃度的藥物作用 48h后,端粒酶活性均有一定程度的下降,藥物濃度越高,端粒酶活性下降越明顯。50mg/L組與未加藥組比較有差異(P＜0.05),100、200 mg/L組與未加藥組比較有顯著差異(P＜0.01)。

附表 硒化殼聚糖對(duì)NB4細(xì)胞端粒酶活性的抑制作用(±s,n=4)

附表 硒化殼聚糖對(duì)NB4細(xì)胞端粒酶活性的抑制作用(±s,n=4)

注:與0mg/L組相比,* P＜0.05** P＜0.01

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3 硒化殼聚糖對(duì)NB4細(xì)胞h TERT mRNA水平的影響,見圖2。圖中 RT-PCR結(jié)果顯示,未加藥組細(xì)胞內(nèi) h TERTmRNA條帶明亮,經(jīng)不同濃度藥物作用48h后,h TERTmRNA條帶則逐漸變淡,50mg/L藥物作用后,亮度約降至對(duì)照的一半,而經(jīng)200mg/L藥物作用后,則條帶幾乎看不清楚,呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。

圖1 硒化殼聚糖對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

圖2 硒化殼聚糖對(duì) NB4細(xì)胞h TERTm RNA水平的影響

討 論

端粒酶是一種由 RNA和蛋白質(zhì)組成的逆轉(zhuǎn)錄酶,其作用是在復(fù)制期(S期)的線粒體末端添加TTAGGG重復(fù)片段,以彌補(bǔ)染色體由于細(xì)胞分裂所出現(xiàn)的末端進(jìn)行性縮短。端?？删S護(hù)染色體的完整性,并參與染色體在細(xì)胞核內(nèi)的定位及基因表達(dá)調(diào)控。端粒的長(zhǎng)短和穩(wěn)定性決定了細(xì)胞的壽命,并與衰老和癌變密切相關(guān)[4]。大多數(shù)的研究表明,人類正常體細(xì)胞中端粒酶常處于失活狀態(tài),而在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)端粒酶呈陽性,在這些腫瘤細(xì)胞內(nèi)由于缺乏調(diào)節(jié)端粒酶活性的機(jī)制,不能下調(diào)端粒酶活性使細(xì)胞停止分裂和退出細(xì)胞周期,從而使細(xì)胞無限增殖,獲得永生性,故而端粒酶活性的調(diào)節(jié)可能是腫瘤治療作用機(jī)制的一部分[5]。h TERT與端粒酶活性的發(fā)揮密切相關(guān),h TERT m RNA水平在端粒酶活性高的細(xì)胞中往往上調(diào)[6],基于此,端粒酶活性和h TERT基因常被看作是評(píng)價(jià)抑癌效果的兩個(gè)重要指標(biāo)。為此,本實(shí)驗(yàn)觀察并探討了硒化殼聚糖對(duì)體外培養(yǎng)的NB4細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其與端粒酶活性和h TERT基因表達(dá)的關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn),硒化殼聚糖可使 NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖受到抑制,25mg/L的硒化殼聚糖作用NB4細(xì)胞 24、48、72h,其抑制率分別為12.2%,13.7%,21.0%,抑制作用不太明顯,當(dāng)其濃度升高至50mg/L時(shí),抑制率則分別上升為18.3%,29.2%和53.4%,抑制作用顯著,再增加藥物濃度,則抑制率進(jìn)一步升高。進(jìn)一步通過檢測(cè)硒化殼聚糖作用48h后 NB4細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性和h TERT mRNA水平變化的結(jié)果表明,同對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用特點(diǎn)相一致,經(jīng)不同劑量硒化殼聚糖作用后,端粒酶活性和h TERT mRNA水平也呈劑量依賴性降低,說明硒化殼聚糖可以通過抑制NB4細(xì)胞端粒酶活性和h TERT表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖。

有報(bào)道稱,端粒酶活性的升高與細(xì)胞周期蛋白表達(dá)呈正相關(guān)[7]。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[8],硒化殼聚糖可下調(diào)NB4細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá),從而使端粒酶活性降低,而后者又可使細(xì)胞染色體末端缺失,染色體缺失又會(huì)使基因組變得不穩(wěn)定,從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,抑制了細(xì)胞的無序增殖,這可能也是硒化殼聚糖能抗 APL的原因之一。

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