南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院(衡陽 421001)

段 薈 付成效 鄒 瑾*

近年來,酒精性肝病已成為我國(guó)僅次于肝炎病毒之后第二大肝病病因。黃芪,含香豆素、黃酮類化合物、皂甙及微量葉酸和數(shù)種維生素等。具有補(bǔ)氣固表,托瘡生肌、利水的功效,主治氣血虛弱、自汗、久瀉脫肛、子宮脫垂、肝炎、腎炎浮腫、蛋白尿、糖尿病、慢性潰瘍等癥。近年來臨床運(yùn)用其保護(hù)肝臟日益廣泛。本實(shí)驗(yàn)擬觀察黃芪總提取物對(duì)酒精致小鼠急性肝損傷模型 MDA、GSH和TG的影響及肝臟保護(hù)作用的影響,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)告如下。

材料與方法

1 材 料

1.1 藥品:黃芪,南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科提供,水提醇沉法濃縮至生藥含量1g/ml。濃縮液滅菌備用;批號(hào):20080815,臨用時(shí)取濃縮液用蒸餾水配制為所需濃度。

1.2 動(dòng)物:雄性昆明種小鼠由長(zhǎng)沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部提供,體質(zhì)量 18～20g,生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK(湘)2006-0001。

1.3 試劑與儀器:MDA和GSH試劑盒:南京建成生物工程研究所提供;722分光光度計(jì)、OLYMPUS AU400全自動(dòng)生化分析儀、組織勻漿器等。

2 方 法[1]

2.1 動(dòng)物分組:雄性昆明種小鼠 50只,稱體質(zhì)量,隨機(jī)分為:空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和黃芪提取物低、中、高劑量組(以下簡(jiǎn)稱低、中、高劑量組)。每組 10只。

2.2 劑量選擇與受試物給予方式:設(shè)黃芪提取物三個(gè)劑量分別為0.5g/(kg· bw)、1.5g/(kg· bw)、4.5g/(kg· bw)(分別相當(dāng)于成人日服 30g劑量的1、3、9倍),受試液配制時(shí)分別取黃芪濃縮液 5ml、15ml、45ml加蒸餾水至200ml,給小鼠按 0.2ml/(10g· bw)體積灌胃。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和乙醇肝損傷模型對(duì)照組,灌胃給予等體積蒸餾水。

2.3 動(dòng)物處理:各劑量組按 1∶3灌胃給予受試液,空白對(duì)照組、模型對(duì)照組灌胃給予植物油,1次 /d,連續(xù) 30d。第 30天各劑量組和模型對(duì)照組灌胃給予50%乙醇 [12ml/(kg· bw)],造成急性肝損傷模型,空白對(duì)照組灌胃給予等體積蒸餾水,禁食 16h處死動(dòng)物,進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)及病理組織學(xué)檢查。

2.4 指標(biāo)檢測(cè):取肝臟用生理鹽水制成10%的肝勻漿,檢測(cè)肝組織中還原型谷胱甘肽(GSH)和甘油三酯(TG)的含量。另取肝臟用0.2M磷酸鹽緩沖液制成5%肝勻漿,檢測(cè)肝組織中丙二醛(MDA)含量。肝組織內(nèi)還原型 GSH、MDA含量按南京建成生物工程研究所提供的測(cè)試盒說明書進(jìn)行,肝組織內(nèi) TG含量用OLYMPUS AU400全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

2.5 病理組織學(xué)檢查:從小鼠肝左葉中部做橫切面取材,冰凍切片,蘇丹Ⅲ染色。鏡檢時(shí)從肝臟的一端視野開始記錄細(xì)胞的病理變化,用40倍物鏡連續(xù)觀察整個(gè)組織切片,觀察脂滴在肝臟的分布、范圍和面積,并按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分:0分:肝細(xì)胞內(nèi)脂滴散在、稀少;1分:含脂滴的肝細(xì)胞不超過1/4;2分:含脂滴的肝細(xì)胞不超過 1/2;3分:含脂滴的肝細(xì)胞不超過 3/4;4分:肝組織幾乎被脂滴代替。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1 黃芪提取物對(duì)小鼠肝臟勻漿 MDA和還原型GSH的影響,見表1。方差齊性檢驗(yàn)顯示肝組織內(nèi)MDA、還原型 GSH含量方差齊,采用單因素方差分析,結(jié)果顯示,各組總體比較有差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),空白對(duì)照組、各劑量組與模型對(duì)照組均數(shù)間肝MDA、還原型 GSH含量的兩兩比較,發(fā)現(xiàn)模型對(duì)照組小鼠肝 MDA含量顯著高于空白對(duì)照組,還原型GSH顯著低于空白對(duì)照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),提示酒精性肝損傷模型成立。中、高劑量組小鼠肝MDA含量顯著低于模型對(duì)照組,還原型 GSH含量顯著高于模型對(duì)照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。低劑量組與模型組MDA和還原型GSH含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 黃芪提取物對(duì)小鼠肝臟勻漿 MDA、GSH含量的影響(n=10,μmol/g肝)[2]

2 黃芪提取物對(duì)小鼠肝臟勻漿 TG的影響,見表2。方差齊性檢驗(yàn)顯示肝組織內(nèi) TG含量方差齊,采用單因素方差分析,結(jié)果顯示,各組總體比較有差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),空白對(duì)照組、各劑量組與模型對(duì)照組均數(shù)間肝 GH含量的兩兩比較,發(fā)現(xiàn)模型對(duì)照組小鼠肝 TG含量顯著高于空白對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),提示酒精性肝損傷模型成立。高劑量組小鼠肝 TG含量顯著低于模型對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。低、中劑量組與模型組 TG含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 黃芪提取物對(duì)小鼠肝臟組織脂肪改變程度的影響,見表2。方差齊性檢驗(yàn)顯示肝組織病變程度平均積分方差齊,采用單因素方差分析,結(jié)果顯示各組總體比較有差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),模型對(duì)照組小鼠組織脂變程度顯著重于空白對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),提示酒精性肝損傷模型成立。高劑量組小鼠肝脂變程度較模型對(duì)照組顯著減輕,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。低、中劑量組與模型組肝脂變程度比較有降低趨勢(shì),但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 黃芪提取物對(duì)小鼠肝臟勻漿 TG含量和肝臟組織脂肪改變程度的影響(n=10)

討 論

小鼠大量攝入乙醇后,在乙醇脫氫酶的催化下大量脫氫氧化,使三羧循環(huán)障礙和脂肪酸氧化減弱而影響脂肪代謝,致使脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積。同時(shí)乙醇能激活氧分子,產(chǎn)生氧自由基導(dǎo)致肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化及體內(nèi)還原型谷胱甘肽的耗竭。

小鼠在 30d喂飼黃芪總提取物后,乙醇灌胃造模,模型組各項(xiàng)指標(biāo)與空白對(duì)照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),提示造模成功。中、高劑量組可顯著升高肝勻漿中肝損傷引起的GSH降低,提示黃芪提取物可通過增強(qiáng)機(jī)體 GSH系統(tǒng)而起到對(duì)肝損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中不飽和脂肪酸氧化分解釋放出的反應(yīng)性醛,是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物,可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),致細(xì)胞腫脹、壞死,其含量的高低可反映肝損傷的程度[3]。中、高劑量組可顯著降低肝勻漿中肝損傷引起的MDA異常升高,提示黃芪提取物同時(shí)可通過抑制自由基和脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,而起到對(duì)肝損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。高劑量組TG含量顯著低于模型組,提示黃芪還可以通過降低TG含量來保護(hù)肝臟。同時(shí)病理學(xué)檢查結(jié)果顯示,高劑量組肝組織病變程度顯著低于模型對(duì)照組。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,證實(shí)黃芪提取物對(duì)酒精性肝損傷小鼠模型有顯著的保護(hù)作用。

黃芪是中醫(yī)臨床常用藥物,前期對(duì)黃芪展開了許多的研究。許多研究證實(shí),黃芪能顯著提高腦、肝組織SOD活性并降低肝臟 MDA含量,能降低缺血再灌法大鼠腎MDA含量及血肌酐濃度,還能提高免疫功能低下小鼠NK細(xì)胞活性[4]。焦柏忠等報(bào)道了由黃芪、熊膽粉等中藥組成的肝脾膠囊,能顯著降低 CCl4所致的小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的升高,降低小鼠肝臟甘油三酯含量,提高肝糖原含量,對(duì)肝硬化模型大鼠,能降低肝硬化形成率,降低肝膠原蛋白,血清球蛋白、肝臟羥脯氨酸和肝總脂量,減輕肝臟病理變化。能增加尿素蛋白和銅藍(lán)蛋白合成,增加膽汁流量[5]。黃芪的主要成分復(fù)雜,其中黃芪多糖顯著降低了血漿、腦勻漿及肝勻漿中過氧化脂質(zhì)(LPO)水平。并顯著降低了TG、TC水平,升高了HDL-C和SOD水平[6]。下一步應(yīng)積極開展對(duì)黃芪各主要成分的藥理作用的研究,有利深化對(duì)黃芪既往功效的認(rèn)識(shí),發(fā)現(xiàn)其新的藥理作用,造福人類社會(huì)。

[1] 衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司.保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范[S].北京:中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部,2003:135-139.

[2] 武新華,馬 琪.復(fù)方丹參對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性腦缺血大鼠肝臟損傷的干預(yù)作用 [J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2006,35(2):220-223.

[3] Koruk M,Taysi S,Savas M C,etal.xidative stress and enzymatic antioxidant status in patients with nonalcoholic steatohepatitis.Acta Clin Iab Sci,2004,34:57-62.

[4] 金若敏,張曉晨,陳長(zhǎng)勛,等.黃芪毛狀根藥理作用的研究[J].中國(guó)中藥雜志,1999,24(10):619-621.

[5] 焦柏忠,劉曉晶,呂美麗,等.肝脾康膠囊藥理作用研究[J].中草藥,1999,30(12):926-929.

[6] 凌洪鋒,蘇 丹,曹 洋,等.黃芪多糖抗氧化作用研究[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐,2005,18(8):872-874.