中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院內(nèi)分泌科(沈陽 110004)

趙 晟 張 微 李 艷 韓 萍*

糖尿病心肌病變(DM)是由糖尿病高血糖狀態(tài)所導(dǎo)致的一種心臟疾病[1]。氧化應(yīng)激是所有糖尿病并發(fā)癥損害發(fā)生的主要因素[2],有證據(jù)顯示急性的血糖波動可以導(dǎo)致機體內(nèi)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[3]。本研究采用給Wistar雄性大鼠間斷或持續(xù)地靜脈輸注50%葡萄糖溶液建立急性血糖波動或持續(xù)性動物模型,探討血糖波動誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)對心肌細胞的影響。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物:選取7周健康雄性Wistar大鼠18只,體重250～280g,由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,清潔度Ⅰ級,隨機被分為3組,分別為對照組、血糖波動組、持續(xù)高血糖組,常規(guī)飼料自由飲水,溫度 22±1℃,濕度 50%左右,明 /暗周期為12h。

1.2 主要試劑:兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體、兔抗大鼠 IκB多克隆抗體免疫組化 SABC染色試劑盒,均購自武漢博士德公司。血清MAD、SOD檢測試劑盒,購自南京建成生物工程研究所。

2 實驗方法

2.1 建立血糖波動動物模型:大鼠適應(yīng)實驗室環(huán)境 3～5d后,將導(dǎo)管分別植入右頸內(nèi)靜脈用于輸液和左頸動脈用于采血。術(shù)后3d,進行輸液。分別予對照組 0.9%生理鹽水,使血糖維持在 5mmol/L左右;予血糖波動組 50%葡萄糖注射液間斷輸注,使血糖在5mmol/L與20mmol/L之間波動,每 2h變動血糖值,持續(xù)2h,見表1。予持續(xù)高血糖組50%葡萄糖注射液持續(xù)輸注,使血糖維持在20mmol/L左右。每小時檢測血糖,所有實驗大鼠輸液時間在48h。

2.2 標本采集:輸注相應(yīng)液體 48h后,取血 5ml,3000轉(zhuǎn) /分離心 15min,取上清于-70℃保存?zhèn)溆谩Ｕ∽笮氖倚募?置于4%含 0.1%DEPC的多聚甲醛中固定。

2.3 指標檢測:①血清指標:用比色法法測定血清MDA、SOD;血糖測定采用葡萄糖氧化酶法測定血糖(BIOSEN5030,德國)。②觀察心肌細胞內(nèi) NF-κB及IκB表達:用免疫組化的方法測定心肌細胞內(nèi) NF-κB、IκB。

2.4 結(jié)果判定:利用 Axioplan 2 imaging顯微圖像分析系統(tǒng)測定 NF-κB、IκB陽性著色面積(%)和平均吸光度,以陽性著色面積×平均吸光度計算NF-κB在細胞核中的相對表達量,IκB在細胞質(zhì)中的相對表達量。

結(jié) 果

1 對照組、血糖波動組、持續(xù)性高血糖組血糖測定值,見表1,表2。

表1 血糖波動組高峰平臺期血糖值與對照組、持續(xù)性高血糖組同時相血糖值的比較(±s)

表1 血糖波動組高峰平臺期血糖值與對照組、持續(xù)性高血糖組同時相血糖值的比較(±s)

持續(xù)高血糖組 20.1±14 21.5±4.1 21.3±0.2 19.6±1.6 20.1±1.0 21.7±2.3 19.9±0.3 19.4±1.6 20.7±3.2 19.7±1.6 21.9±2.0 20.7±3.0

表2 血糖波動組低谷平臺期血糖值與對照組、持續(xù)性高血糖組同時相血糖值的比較(±s)

表2 血糖波動組低谷平臺期血糖值與對照組、持續(xù)性高血糖組同時相血糖值的比較(±s)

血糖波動組 5.6±0.3 5.0±4..3 6.3.±1.4 4.7±2.0 4.9±1.9 5.7±4.4 4.9±0.7 5.4±3.1 4.2±0.7 5.7±3.2 6.0±2.0 4.7±3.6持續(xù)高血糖組 19.6±3.0 20.1±5.9 21.5±1.2 18.4±4.6 22.1±5.12 0.7±3.2 18.7±1.3 23.5±5.6 20.2±4.8 20.1±3.6 18.0±7.0 22.9±1.0

2 血清 MDA、SOD表達水平,見表3。血糖波動組及持續(xù)性高血糖組血清中 MDA、SOD表達水平明顯高于對照組(P＜0.05),而且血糖波動組血清中 MDA、MDA/SOD比值均高于持續(xù)性高血糖組(P＜0.01);血糖波動組MDA/SOD比值顯著高于對照組及持續(xù)性高血糖組(P＜0.01),持續(xù)性高血糖組 MDA/SOD比值高于對照組但是無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

表3 對照組、血糖波動組及持續(xù)性高血糖組血清 MDA(nmol/ml)、SOD(U/ml)水平

血糖波動組、持續(xù)性高血糖組心肌細胞核內(nèi) NF-κB、IκB的表達明顯高于對照組(P＜0.05),血糖波動組與持續(xù)性高血糖組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);血糖波動組、持續(xù)性高血糖組心肌細胞的NF-κB/IκB明顯高于對照組(P＜0.05),血糖波動組心肌細胞內(nèi)表達的NF-κB/IκB比值低于持續(xù)性高血糖組,但是無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

3 心肌細胞內(nèi) NF-κB、IκB及NF-κB/IκB比值表達,見表4。

表4 對照組、血糖波動組及持續(xù)性高血糖組血清MDA、SOD水平

討 論

NF-κB是一種具有多向性的轉(zhuǎn)錄因子,能被多種物質(zhì)刺激激活。NF-κB蛋白 N-末端具有 Rel蛋白同源結(jié)構(gòu)域(Rel homology domain,RHD),該結(jié)構(gòu)域是NF-κB二聚化的活性位點、與定位細胞核 DNA結(jié)合位點和IκB相互作用位點,蛋白 C末端擁有 IκB特征性結(jié)構(gòu)域-錨蛋白重復(fù)序列[3,4]。當細胞未受到外界刺激時,IκB與NF-κB結(jié)合形成復(fù)合體,存在于細胞質(zhì)內(nèi);當細胞受到外界刺激時如細胞因子等,細胞質(zhì)中的IκB激酶(IκB kinase,IKK)發(fā)生積聚并被激活,活化的IKK能使 IκB磷酸化,之后 IκB與NF-κB分離,并被降解,同時NF-κB被激活,而進入細胞核促進炎癥因子如細胞間粘附因子(Intercellular adhesion molecular-1,ICAM-1)等基因轉(zhuǎn)錄表達。

本研究對 Wistar大鼠心肌細胞的研究過程中,發(fā)現(xiàn)血糖波動組及持續(xù)性高血糖組的心肌細胞核NF-κB表達明顯高于對照組(P＜0.05)。此外,發(fā)現(xiàn)血糖波動組及持續(xù)性高血糖組大鼠血清中MDA、MDA/SOD的水平顯著高于對照組(P＜0.05),而血糖波動組表達又顯著高于持續(xù)性高血糖組(P＜0.01),反映血糖波動和持續(xù)性高血糖都能誘導(dǎo)機體出現(xiàn)強烈的氧化應(yīng)激反應(yīng),而且血糖波動誘導(dǎo)機體氧化應(yīng)激的作用更強。血糖波動和持續(xù)性高血糖通過誘導(dǎo)實驗雄性Wistar大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增強,激活心肌細胞內(nèi)NF-κB,從而入核表達。Osorio-Fuentealba C等[5,6]在缺氧的心肌細胞中發(fā)現(xiàn)活性氧簇(Reactive oxidative species,ROS)明顯升高,ROS激活了NF-κB,啟動介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

NF-κB作為典型的多向性轉(zhuǎn)錄因子,在許多的免疫應(yīng)答反映的信號途徑中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。NF-κB能被多種刺激如細胞因子等激活,活化的NF-κB介導(dǎo)多種促炎癥的細胞因子和粘附分子的表達和合成[7]。心肌細胞內(nèi) NF-κB細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的功能非常復(fù)雜,除促進促炎癥的細胞因子的表達外,NF-κB還能激活其他多種基因的表達,繼而影響心肌細胞的生長、收縮、死亡及細胞外基質(zhì)重塑等病理生理過程[8]。

近年來研究顯示,NF-κB活化導(dǎo)致細胞內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric-oxide synthase,iNOS)表達,促進細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增加作用[9]。而大量ROS的蓄積可激活 JNK介導(dǎo)的線粒體依賴性細胞凋亡信號途徑,從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡[10～12]。糖尿病心肌細胞存在明顯的凋亡現(xiàn)象,而影響凋亡的原因之一就是高糖。本研究發(fā)現(xiàn)血糖波動能導(dǎo)致機體 ROS增多及心肌細胞內(nèi) NF-κB激活,后者激活可導(dǎo)致炎癥因子進一步表達,可能是糖尿病時血糖波動導(dǎo)致心肌細胞損害的主要病理生理機制之一。

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