葛仕豪,萬雙秀,王樹迎

(1.菏澤學(xué)院動物科學(xué)系,山東菏澤274015;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東泰安271018)

下丘腦合成的促性腺激素釋放激素(GnRH)以脈沖分泌方式到達(dá)垂體前葉,調(diào)控腺垂體對FSH、LH的合成與分泌[1],GnRH也可直接作用于性腺,調(diào)控性腺類固醇激素的分泌,GnRH對生殖功能的調(diào)控必須以促性腺激素釋放激素受體(GnRHR)為介導(dǎo)[2]。近年來,GnRH R的分布、表達(dá)、調(diào)節(jié)等在神經(jīng)內(nèi)分泌、生殖生物學(xué)領(lǐng)域得到了深入的研究,但對GnRHR在青山羊垂體和卵巢內(nèi)的分布卻未見有報道,因此我們以高繁殖力的濟(jì)寧青山羊為研究對象,探討GnRH R在其垂體和卵巢內(nèi)的形態(tài)結(jié)構(gòu)及分布規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 選取臨床健康、未孕雌性濟(jì)寧青山羊6只,年齡2～3歲,體重約20 kg。

1.2 取材制片 于2008年9月份宰殺發(fā)情期和間情期的濟(jì)寧青山羊各3只,在發(fā)情期取垂體和卵巢,而間情期只取卵巢,分別放入4%多聚甲醛固定,經(jīng)梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,連續(xù)切片,片厚4～6μm,垂體和卵巢組織塊每隔10片連續(xù)取2片,分為兩套切,其中一套用于GnRH R免疫組化SABC染色,另一套用作陰性對照試驗。

1.3 免疫組化SABC法染色程序 (1)切片脫蠟至水后,室溫條件下 3%H 2O2作用 15 min。(2)微波修復(fù)2次后用正常山羊血清室溫下封閉30 min。(3)加入兔抗GnRHR血清(1∶150),然后4℃過夜。(4)加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG 37℃下30 min。(5)加入SABC復(fù)合物37℃下作用30 min。(6)DAB鏡下顯色5～10 min。(7)蘇木素輕度復(fù)染,脫水,透明,封片。以上試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

對照試驗用正常山羊血清封閉液代替一抗,其余步驟同上。

1.4 圖像分析 采用美國Media Cybernetic公司生產(chǎn)的Image-Pro Plus圖像分析軟件(Version 4.1)對垂體和卵巢進(jìn)行圖像分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析處理 免疫組化圖像分析所得數(shù)據(jù)用EXCEL2003進(jìn)行統(tǒng)計,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示,用 SPSS 13.0進(jìn)行 t檢驗和單因子方差分析。

2 結(jié)果

2.1 垂體中GnRHR免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞 處于發(fā)情期的濟(jì)寧青山羊腺垂體內(nèi)存在大量GnRH R免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞,約占細(xì)胞總數(shù)的31.5%(表1),細(xì)胞呈圓形、梭形、三角形等(見中插彩版圖1)。

表1 濟(jì)寧青山羊腺垂體和卵巢內(nèi)GnRHR陽性細(xì)胞比和平均光密度

2.2 卵巢中GnRHR免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞 在發(fā)情期,原始卵泡和初級卵泡內(nèi)未發(fā)現(xiàn)GnRHR陽性細(xì)胞,但其存在于次級卵泡和成熟卵泡的顆粒層細(xì)胞,呈黃色或棕黃色,而在卵泡膜細(xì)胞染色較淡或不著色(見中插彩版圖2～5)。在間情期,黃體中的陽性物質(zhì)主要見于粒黃體細(xì)胞,膜黃體細(xì)胞未見,白體和閉鎖卵泡中也存在GnRH R陽性細(xì)胞(見中插彩版圖6～8)。

次級卵泡內(nèi)GnRHR陽性細(xì)胞比顯著低于成熟卵泡(P＜0.05),但平均光密度無明顯差異(P＞0.05)。黃體中的粒黃體細(xì)胞也表現(xiàn)出較強(qiáng)的反應(yīng)強(qiáng)度,其陽性細(xì)胞比與次級卵泡相比無明顯差異(P＞0.05)(表1)。

3 討論

3.1 GnRHR在垂體內(nèi)的作用及分布 Szende B[3]和Stenfano La ROsa[4]等分別對大鼠和人的GnRHR陽性細(xì)胞在腺垂體內(nèi)的分布進(jìn)行了研究,他們都在遠(yuǎn)側(cè)部的促性腺激素(GTH)細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)有GnRHR陽性物質(zhì)存在,在神經(jīng)垂體未發(fā)現(xiàn),這和筆者得出的結(jié)論相似。筆者認(rèn)為在發(fā)情期GnRH通過結(jié)合GnRHR,以促進(jìn)GTH的分泌,從而間接促使卵巢內(nèi)卵泡的發(fā)育成熟并排卵。

3.2 GnRHR在卵巢內(nèi)的作用及分布 濟(jì)寧青山羊原始卵泡和初級卵泡都未發(fā)現(xiàn)GnRH R陽性細(xì)胞,Choi J H等[5]在人的原始卵泡和早期囊狀卵泡也沒有發(fā)現(xiàn)GnRHR,說明GnRH對此階段的卵泡可能沒有調(diào)控作用。從次級卵泡到成熟卵泡,卵巢顆粒層細(xì)胞開始出現(xiàn)GnRHR陽性物質(zhì),并且隨著卵泡的發(fā)育,陽性細(xì)胞比逐漸增大,說明GnRH對卵巢性腺類固醇激素的分泌調(diào)控能力也逐漸增強(qiáng),從而促進(jìn)濟(jì)寧青山羊發(fā)情并排卵。Kogo H等[6]研究了鼠卵巢的GnRHR mRNA,發(fā)現(xiàn)其也主要集中分布于卵巢顆粒層細(xì)胞,而在卵母細(xì)胞和膜細(xì)胞未見。濟(jì)寧青山羊次級卵泡和成熟卵泡GnRHR陽性細(xì)胞平均光密度無差異,筆者推斷,GnRH與Gn-RHR在濟(jì)寧青山羊次級卵泡與成熟卵泡的結(jié)合能力相似。

Choi J H等[5]用免疫組織化學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn),在人的卵巢粒黃體細(xì)胞發(fā)現(xiàn)有GnRHR陽性物質(zhì),而在膜黃體細(xì)胞未發(fā)現(xiàn),本試驗結(jié)果與之相似。粒黃體細(xì)胞具有分泌性激素的作用,因此筆者認(rèn)為,GnRH通過與黃體內(nèi)的GnRHR結(jié)合,調(diào)控間情期孕酮的分泌。黃體退化后形成白體,濟(jì)寧青山羊白體和閉鎖卵泡內(nèi)有少量的GnRHR陽性細(xì)胞,其是否參與了卵泡的閉鎖機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

[1] Robert Grosse,Andrea Schmid,Torsten Schoneberg,et al.Gonadotropin-releasing hormone receptor initiates multiple signaling pathways by ex clusively coupling to Gq/11 p roteins[J].The Journal of Biological Chemistry,2000,275(13)：9193-9200.

[2] Claytoy R N,Catt K J.Gonad otropin-releasing hormone receptor：charaterization,phy siological regulation,and relationship to reproductive function[J].Endocr Rev,1981,2：186.

[3] Szende B,Srkalovic G,Timar J,et al.Localization of receptors for luteinizing hormone-releasing hormone in pancreatic and mammary cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci,1991,88：4153-4156.

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[5] Choi J H,Gilks CB,Auersperg N,et al.Immunolocalization of Gonadotropin-Releasing Hormone(Gn RH)-I,GnRH-II,and Type-I GnRH Receptor during Follicular Development in the Human Ovary[J].The Endocrine Society,2006,9：1-30.

[6] Kogo H,Fujimoto T,Park M K,et al.Gonad otropin-releasing hormone receptor m RNA expression in the ovaries of neonatal and adult rats[J].Cells Tissues Organs,1999,164：14-22.