娜仁高娃,陳 霞,吳聰明

(中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京海淀100193)

彎曲菌(Campylobacter)尤其是空腸彎曲菌(C.jejuni)是重要的人畜共患病病原菌,在人可引起急性胃腸炎,感染嚴重者伴有心內(nèi)膜炎、肺炎、敗血癥、血栓靜脈炎、腦膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎以及格林-巴利綜合征等疾病[1-3]。家禽、家畜、寵物等動物是彎曲菌的常見宿主,因此研究動物源彎曲菌具有重要的公共衛(wèi)生意義。由于彎曲菌體外培養(yǎng)條件苛刻,需要專門的培養(yǎng)設(shè)備,而且生長周期較長,鑒定復(fù)雜,普通實驗室難以開展相關(guān)工作。本文在研究動物源彎曲菌過程中摸索出一套雞源空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的分離培養(yǎng)及多重PCR鑒定方法,該方法操作簡便、快速,易于掌握,適用于基層實驗室分離鑒定彎曲菌。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)控菌株 空腸彎曲菌標準菌株ATCC 33560,金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC29213,均購于美國菌種保藏中心;大腸桿菌標準菌株ATCC25922,購于中國藥品生物制品檢定所,雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌由本實驗室保存。

1.2 試劑及培養(yǎng)基 Skirrow氏彎曲菌選擇性培養(yǎng)基基礎(chǔ)及 Campy lobacter supplementⅢ(Skirrow),購自Sigma公司;布氏肉湯、哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)及無菌脫纖綿羊血,購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司;2X Taq PCR M asterM ix、低分子量 PCR M arker,購自天根生化科技(北京)有限公司;彎曲菌API鑒定條,購自Biomerieux公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 樣本采集及菌株分離 用10 mL滅菌試管采集新鮮雞糞或盲腸內(nèi)容物樣本3～5 g,低溫包裝運送至實驗室,用接菌環(huán)沾取少量(約0.1 g)劃線接種到Skirrow彎曲菌選擇性培養(yǎng)基上。將接種好的培養(yǎng)基置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi),微需氧條件下(5%O2、10%CO2、85%N2),42℃培養(yǎng) 48～ 72 h。選取不溶血半透明圓形菌落接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)。

1.4 菌株API鑒定 選取氧化酶結(jié)果陽性的菌株,用生理鹽水洗下哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上的純培養(yǎng)物制成6個麥氏濁度的菌懸液,按彎曲菌API鑒定條(API 20 800)使用說明書接種并培養(yǎng),判讀培養(yǎng)結(jié)果,查閱API 20 800鑒定標準進行菌株鑒定。

1.5 PCR引物設(shè)計 根據(jù)GenBank登錄的序列和Georgios Keramas[4-5]等報道的序列合成 3對PCR引物：針對彎曲菌屬16S rRNA基因的引物(16S-F和16S-R);針對空腸彎曲菌hipO基因的引物(HIP-F和 H IP-R);針對結(jié)腸彎曲菌 16S-23S rRNA基因的引物(CC-F和CC-R)。各對引物核苷酸序列及預(yù)期擴增片段長度見表1。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1 用于鑒別空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的3對PCR引物序列、預(yù)期擴增片段長度

1.6 PCR鑒定 挑取哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上的純培養(yǎng)物置于盛有800μL pH8.0 Tris-EDTA的離心管中,12 000 r/m in常溫離心1 m in,去上清。重復(fù)一次上述離心步驟后,用80μL Tris-EDTA重懸沉淀,放入100℃沸水中煮沸10 m in。取出置于冰浴中冷卻5m in后,12 000 r/m in(4℃)離心3 m in,取上清液作為PCR模板。PCR反應(yīng)體系為20μL,其中2X Taq PCR M asterM ix 10μL,DNA模板1 μL,上下游引物(10 nmol/L)各0.5μL,滅菌超純水補足至20μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性10m in,94℃變性1 min,56℃退火40 s,72℃延伸 1 min,30個循環(huán)后 72℃再延伸 7 min。PCR產(chǎn)物以 DL-2 000作為DNA M arker,以1.2%瓊脂糖凝膠(含有0.5mg/L Goldview染料)、120 V電泳25m in,A lpha凝膠成像系統(tǒng)成像。PCR過程中以空腸彎曲菌ATCC33560作為陽性質(zhì)控,以大腸桿菌ATCC25922作為陰性質(zhì)控。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài) 雞源的彎曲菌主要為空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌,兩者均為嗜熱微需氧菌,體外最適培養(yǎng)條件為 42℃,5%O2、10%CO2、85%N2。上述兩種彎曲菌在血瓊脂培養(yǎng)基上不溶血,初代分離的典型菌落形態(tài)為圓形,直徑 1～2 mm,隆起、中凸、光滑、閃光、邊緣整齊、半透明而中心顏色較暗,菌落呈淺灰色或黃褐色。

2.2 特異性試驗 采用本文建立的PCR方法,擴增空腸彎曲菌ATCC33560,在314 bp和149 bp處分別獲得預(yù)期的屬特異性條帶和種特異性條帶;擴增大腸桿菌ATCC25922未出現(xiàn)任何條帶(見圖1)。上述結(jié)果說明所建立的PCR法有較強的特異性。

圖1 彎曲菌多重PCR鑒定電泳結(jié)果

2.3 方法應(yīng)用 應(yīng)用建立的彎曲菌臨床分離及多重PCR鑒定方法,我們從774份新鮮雞糞樣品中分離出261株彎曲菌,其中208株空腸彎曲菌,53株結(jié)腸彎曲菌,總體分離率為33.7%。

2.4 PCR鑒定方法驗證 從PCR鑒定的彎曲菌中隨機挑取26株彎曲菌(其中空腸彎曲菌16株;結(jié)腸彎曲菌11株)進行API鑒定,鑒定結(jié)果與PCR結(jié)果一致。表明上述建立的彎曲菌多重PCR鑒定方法完全可在臨床菌株分離工作中應(yīng)用。

3 討論

3.1 彎曲菌為苛養(yǎng)菌,營養(yǎng)要求高,體外培養(yǎng)需在培養(yǎng)基中加入一定量的全血或血清,通常含量為5%。此外,臨床分離彎曲菌時選擇性培養(yǎng)必不可少,加入一定量的抗生素增補劑(如多粘菌素B,1 250 IU;萬古霉素,5mg;三甲氧芐氨嘧啶,2.5mg)可抑制其他腸道菌的生長,以提高彎曲菌的分離率。

3.2 生化鑒定彎曲菌不僅操作繁瑣,而且結(jié)果不典型時,常需要傳代培養(yǎng)后再鑒定,檢測周期一般需要2～3周。法國生物梅里埃生產(chǎn)的API鑒定條一定程度上簡化了繁瑣的生化鑒定程序,但價格昂貴,使之難以成為一般實驗室的常規(guī)鑒定方法。本文建立的空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌多重PCR鑒定方法,不僅靈敏度高、特異性強,而且操作簡便快速、成本低廉,適用于基層實驗室開展雞源彎曲菌分離鑒定及其他相關(guān)研究工作。

3.3 H uo-Shu H等[6]應(yīng)用ceuE基因建立了檢測空腸、結(jié)腸彎曲菌的多重PCR方法,可分別擴增出了645 bp和783 bp的特異性片段,但部分腸道菌可擴增出小于645 bp的非特異性片段。何蕊等[7]以 mapA基因建立了檢測空腸彎曲菌的PCR方法,但mapA基因的特異性不強,而且并非所有的空腸彎曲菌都能夠擴增出589 bp的特異性片段。本文建立的多重PCR法不僅能擴增出彎曲菌屬的特異性片段,而且能分別擴增出空腸、結(jié)腸彎曲菌各自的特異性片段,因此具有較強的特異性。尤其是本方法PCR擴增的馬脲酸酶基因(hipO)為空腸彎曲菌(包括空腸亞種和德萊亞種)所特有[8],因此能有效區(qū)分空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌。

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