蒙振畝,張民秀,侯韶毅,覃 勇,盧桂娟,蘭家暖,廖承球,黃偉堅(jiān)

(1.廣西百色市動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心,廣西百色533000;2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧530004;3.廣西麗原生物股份有限公司,廣西南寧530001)

馬流感(EI)是由馬流感病毒(EIV)引起馬屬動(dòng)物的一種高度接觸性傳染病,臨床特征主要為發(fā)燒、咳嗽、流鼻液、母馬流產(chǎn)等,本病傳播迅速,發(fā)病率極高,常達(dá)100%?；疾?dòng)物呈現(xiàn)運(yùn)動(dòng)失調(diào),精神沉郁而不愿活動(dòng),喪失勞動(dòng)力,并常繼發(fā)其他細(xì)菌性疾病導(dǎo)致死亡,對(duì)養(yǎng)馬業(yè)和賽馬業(yè)造成巨大影響。2007年起我國的甘肅,新疆,內(nèi)蒙古,青海以及東北的主要養(yǎng)馬地區(qū)均有馬流感發(fā)生的報(bào)道[1],2009年11月底,廣西百色市的多個(gè)馬群中發(fā)生了疑似馬流感的病例,我們對(duì)疑似病馬采集鼻拭子并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷,確診為由 H3N8馬流感病毒引起的馬流感。

1 發(fā)病情況和流行病學(xué)

百色市是廣西的主要養(yǎng)馬地區(qū),全年存欄量23萬匹左右。近年來,每年都有疑似馬流感病例發(fā)生,但一直都未能對(duì)該病進(jìn)行確診。2009年11月22日開始,多個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)部分馬匹出現(xiàn)咳嗽、流鼻涕、發(fā)熱等癥狀,經(jīng)調(diào)查本次共有5個(gè)縣區(qū)15個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)32個(gè)行政村發(fā)生疑似馬流感病例,發(fā)病馬490匹,病死數(shù)為10匹。

2 臨床癥狀

首先個(gè)別病馬出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、流大量鼻涕、病馬體溫升高等癥狀,并迅速波及整屯所有馬匹,馬匹出現(xiàn)肌肉疼痛,不愿運(yùn)動(dòng),喪失勞動(dòng)能力。病馬經(jīng)過治療可康復(fù),病程4～7 d,病馬死亡率低,死亡率為0.08%。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 病料檢測(cè) 應(yīng)用針對(duì)M基因設(shè)計(jì)的流感病毒通用檢測(cè)引物[2]對(duì)15份鼻拭子樣品進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果顯示,有3個(gè)樣品出現(xiàn)預(yù)計(jì)約244 bp的片段,判定這3個(gè)樣品為陽性(如圖1)。

3.2 病毒分離 對(duì)陽性樣品按常規(guī)方法加入雙抗處理樣品后,過濾除菌后接種到MDCK細(xì)胞上,細(xì)胞在24 h后開始出現(xiàn)病變,細(xì)胞變圓腫脹,脫落,細(xì)胞核固縮或破裂,有部分細(xì)胞脫落(圖2)。72 h收毒,經(jīng)過RT-PCR檢測(cè),電泳后出現(xiàn)經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)顯示出預(yù)計(jì)片段。

3.3 NA基因的擴(kuò)增及初步比較 設(shè)計(jì)引物,對(duì)其中一份出現(xiàn)細(xì)胞病變的細(xì)胞毒樣品提取 RNA后,經(jīng)過RT-PCR擴(kuò)增1 413 bp(NA基因)得到與預(yù)計(jì)的大小相一致。經(jīng)克隆到p MD-18T載體后測(cè)序比對(duì)分析,NA基因的核苷酸序列與2007～2008年的新疆株、遼寧株馬流感毒H3N8株的同源性為98%～99%,屬于同一個(gè)亞系。

4 討論

根據(jù)其發(fā)病較急,傳播迅速,患病馬匹出現(xiàn)呼吸困難,咳嗽,流大量鼻涕,病馬體溫升高等癥狀可初步判斷為馬流感。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)鼻拭子進(jìn)行流感病毒RT-PCR診斷,對(duì)陽性樣品病毒分離在MDCK細(xì)胞上出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變,并擴(kuò)增出相應(yīng)的NA基因,測(cè)序結(jié)果表明屬于馬流感病毒H3N8血清型?？纱_定本次廣西百色市發(fā)生的馬匹疾病是由馬流感病毒引起的。

從對(duì)該毒株NA基因的比較分析結(jié)果表明,其與2007～2008年在我國西北和東北地區(qū)的馬流感病毒毒株同源性極高,高達(dá)98%～99%,說明廣西地區(qū)的馬流感流行毒株與東北和西北地區(qū)的流行毒株屬于同一個(gè)亞系,可能來源于同一毒株。但近年來百色無從這些地方引種的歷史,因此流行同一個(gè)亞系的原因有待進(jìn)一步研究。

廣西百色市地處西南云貴高原,馬成為必不可少的交通工具和勞動(dòng)工具。百色地區(qū)的全年存欄量為20多萬匹馬。馬流感是一種高傳染病的呼吸道疾病,本病傳播迅速,潛伏期短,往往呈現(xiàn)突然發(fā)病,患病馬匹會(huì)出現(xiàn)發(fā)燒、干咳、流鼻涕和乏力等癥狀,并有2～3周無法行動(dòng)。百色市近年來經(jīng)常發(fā)生疑似馬流感的流行,嚴(yán)重影響百色的養(yǎng)馬業(yè)發(fā)展。此次馬流感的確診將對(duì)今后當(dāng)?shù)伛R流感的預(yù)防和控制提供幫助。

馬流感的控制主要依賴疫苗接種,但是馬流感病毒容易產(chǎn)生變異,出現(xiàn)抗原漂移和轉(zhuǎn)變,給疫苗的研究和使用帶來許多困難。國外多次出現(xiàn)免疫馬群流行馬流感的報(bào)道[3-5],因此要控制好馬流感應(yīng)加強(qiáng)對(duì)馬流感病毒血清學(xué)、病原學(xué)和分子流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)工作。了解馬流感病毒在當(dāng)?shù)氐牧餍刑攸c(diǎn),采取針對(duì)性的措施才能有效控制馬流感的流行。

[1] 相文華.中國馬流感的研究現(xiàn)狀[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊,2009,10：24-26.

[2] FOUCHIER RON A M,BESTEBROER THEO M,HERFST SANDER,et al.Detection of influenza A viruses from different species by PCR amplification conversed sequence in the Matrix gene[J].JClin Microbiol,2000,38(11)：4096-4101.

[3] BARBIC L,MADIC J,TURK N,et al.Vaccine failure caused an outbreak of equine influenza in Croatia[J].Vet Microbiolo,2009,133(1/2)：164-171.

[4] MARTELLA V,ELIA G,DECARO N,et al.An outbreak of equine influenza virusin vaccinated houses in Italy is due to an H 3N8 strain closely relate to recent North American representatives of the Florida sub-lineage[J].Vet Microbiolo,2007,121(1/2)：56-63.

[5] VAN M AANEN C,VAN ESSEN G J,MINKE J,et al.Diagnostic methods applied to analysis of an outbreak of equine influenza in a riding school in which vaccine failure occurred[J].Vet Microbiolo,2003,93(4)：291-306.