張 品 鄧乾春 黃慶德 黃鳳洪

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所,武漢 430062)

無溶劑直接酯化法合成α-亞麻酸植物甾醇酯工藝研究

張 品 鄧乾春 黃慶德 黃鳳洪

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所,武漢 430062)

研究了植物甾醇與α-亞麻酸無溶劑直接酯化法合成α-亞麻酸植物甾醇酯的最佳工藝條件。通過單因素試驗(yàn)研究了α-亞麻酸和植物甾醇不同質(zhì)量比、催化劑添加量、反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度對α-亞麻酸植物甾醇酯酯化率的影響。通過正交試驗(yàn)對α-亞麻酸植物甾醇酯合成工藝進(jìn)行優(yōu)化,最終得到優(yōu)化工藝條件為:即真空度為 0.03～0.04 MPa,α-亞麻酸與植物甾醇的質(zhì)量比4∶1,催化劑量為 2.5%,反應(yīng)時(shí)間為 8 h,反應(yīng)溫度 140℃,在此條件下,α-亞麻酸植物甾醇酯的酯化率為 (98.88±0.984)%。因此,通過本論文的研究得到了一種綠色、安全、高效的α-亞麻酸植物甾醇酯合成工藝。

植物甾醇 α-亞麻酸 直接酯化 α-亞麻酸植物甾醇酯

植物甾醇是一種存在于植物體內(nèi)的天然活性物質(zhì),其結(jié)構(gòu)與動(dòng)物體內(nèi)的膽固醇相似[1]。至今已發(fā)現(xiàn)有 100多種植物甾醇,含量較豐富的主要有β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇[2-3]。植物甾醇主要是通過抑制膳食和膽汁中的膽固醇在腸道內(nèi)的吸收從而達(dá)到降低膽固醇的功效[2,4-5]。除此之外,植物甾醇還具有抗癌、抗氧化[2,6]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[7]和抗炎[8]等功效,被應(yīng)用于制藥、保健品和化妝品等工業(yè)中[1]。但是,結(jié)晶形式的植物甾醇在人體內(nèi)的溶解性和生物利用性比較差;并且植物甾醇的疏水性和油溶性較差造成了使用上的困難[9-10]。α-亞麻酸是 9c,12c,15c-十八碳三烯酸,為人體必需的多不飽和脂肪酸,對人體具有不可缺少的生理活性。α-亞麻酸是合成二十碳五烯酸 (EPA)、二十二碳六烯酸 (DHA)的前體物質(zhì),具有降血脂、降膽固醇、促進(jìn)脂肪代謝和肝細(xì)胞再生[11]、抗過敏[12]、抗癌[13]等作用,但是其分子中存在三個(gè)共軛雙鍵,極易被氧化。油溶性與穩(wěn)定性均佳的植物甾醇脂肪酸酯合成工藝的出現(xiàn)使這些難題得以解決[14],植物甾醇脂肪酸酯可以替代植物甾醇添加到各種食品中并且不改變產(chǎn)品的最終風(fēng)味,且能增加產(chǎn)品生物活性,如植物甾醇亞油酸酯、植物甾醇油酸酯等[15-17]。但目前缺乏對α-亞麻酸植物甾醇酯合成工藝的系統(tǒng)研究,現(xiàn)有工藝也存在經(jīng)濟(jì)成本高和副產(chǎn)物較多等問題[15-16],本文采用植物甾醇與α-亞麻酸直接酯化的方法合成α-亞麻酸植物甾醇酯,通過正交試驗(yàn)對酯化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,以期得到一種綠色合成工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物甾醇 (總質(zhì)量分?jǐn)?shù) 95%,其中含β-谷甾醇77%,菜籽甾醇 17%,豆甾醇 5%,菜油甾醇 1%):西安藍(lán)天生物工程有限公司;α-亞麻酸 (80%):河南利諾生化有限責(zé)任公司。

Agilent 6890氣相色譜儀:美國 Aglient公司;AS600型核磁共振儀:美國瓦里安公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 α-亞麻酸植物甾醇酯的合成方法

在 50 mL錐形瓶中加入一定比例的α-亞麻酸、植物甾醇和催化劑,置于空氣搖床上振搖 30 min后,在真空度為 0.03～0.04 MPa,一定溫度條件下反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,水洗 3次去除催化劑,無水硫酸鈉干燥即得α-亞麻酸植物甾醇酯粗產(chǎn)品。將α-亞麻酸植物甾醇酯粗產(chǎn)品加熱至 100℃熔融后,加入 5%～10%活性白土,在抽真空條件下 110℃攪拌 1～2 h后,過濾,得到淡黃色、可在 30℃以上自由流動(dòng)的、黏稠狀流體。

1.2.2 酯化率的測定[16,18]

氣相色譜條件為:DB-5HT型石英毛細(xì)管色譜柱 (15.0 m ×320μm ×0.10μm),FI D檢測器;進(jìn)樣量為 1.0μL,高純 N2為載氣,進(jìn)樣口溫度 350℃,檢測器溫度 350℃,恒壓模式;分流比10∶1,H2流量為40.0 mL/min,空氣流量為 400 mL/min,尾吹氣 N2流量為 30 mL/min。程序升溫初溫 180℃,以20℃/min升至 230℃,保持 0.5 min;再以 5℃/min的速率升至 260℃,保持 0.5 min;然后以 30℃/min的速率升溫至 320℃,保持 0.5 min;最后以10℃/min的速率升溫至 380℃,保持 3 min。

通過 GC圖譜中各組分的峰面積計(jì)算α-亞麻酸植物甾醇酯的酯化率 (DE),如公式 (1)

式中:A為植物甾醇的總峰面積;B為α-亞麻酸植物甾醇酯的峰面積;1.629為植物甾醇與α-亞麻酸植物甾醇酯的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

1.3 單因素試驗(yàn)

以α-亞麻酸植物甾醇酯酯化率為指標(biāo),選取原料質(zhì)量比 (α-亞麻酸:植物甾醇)、催化劑用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間 4個(gè)影響合成工藝效果因素做單因素試驗(yàn),確定各因素的合適范圍。

1.4 正交試驗(yàn)

為了減少試驗(yàn)次數(shù),探索各因素對α-亞麻酸植物甾醇酯酯化率的影響,確定工藝條件,在前期單因素分析結(jié)果基礎(chǔ)上,采用正交試驗(yàn)法進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)。

1.5 α-亞麻酸植物甾醇酯的薄層色譜分離[15]

將粗產(chǎn)品經(jīng)過薄層色譜進(jìn)一步分離,展開劑為石油醚 (60～90 ℃),乙醚 ∶乙酸 (90∶10∶1,v∶v∶v),碘蒸氣為顯色劑,并與反應(yīng)底物α-亞麻酸和植物甾醇進(jìn)行比較。

1.6 核磁共振譜儀分析[19]

按 1.6方法對產(chǎn)品進(jìn)行分離以后,將α-亞麻酸植物甾醇酯展開部分小心刮下,用 CDCl3溶劑浸泡約 20 min,待硅膠層呈現(xiàn)白色后進(jìn)行離心,取上層溶劑通過核磁共振譜儀對α-亞麻酸植物甾醇酯進(jìn)行1H譜和13C譜的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 反應(yīng)體系和催化劑的選擇

在真空度為 0.03～0.04 MPa,原料質(zhì)量比為3∶1,催化劑用量為反應(yīng)原料質(zhì)量的 2%,反應(yīng)溫度130℃,反應(yīng)溫度為 6 h條件下,分別選取甲醇鈉、氯化鉀、檸檬酸、硫酸氫鈉、乙酸鈉、苯甲酸鈉、無水亞硫酸鈉、氫氧化鈣、氫氧化鈉、氧化鎂、氧化鈣、氧化鑭及其復(fù)合催化劑對反應(yīng)進(jìn)行催化,不同催化劑對α-亞麻酸植物甾醇酯酯化率的影響如表 1所示。結(jié)果表明,使用硫酸氫鈉作為催化劑時(shí)的酯化率最高,產(chǎn)品顏色較淺,并且水溶性的硫酸氫鈉在反應(yīng)后也容易除去,不會在最終產(chǎn)品中殘留。孟祥河等[20]的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)氧化鎂、氧化鈣、氧化鑭以一定配比復(fù)合后催化效果明顯提高,試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)與其相似,但是在相同條件下,硫酸氫鈉的催化效果要優(yōu)于這種復(fù)合催化劑;如果使用復(fù)合催化劑,必須進(jìn)一步提高反應(yīng)溫度才能使酯化率達(dá)到 90%以上,這就有可能導(dǎo)致副產(chǎn)物的產(chǎn)生。故選擇硫酸氫鈉為催化劑。

由于酯化與水解是可逆的化學(xué)平衡反應(yīng),為使酯化進(jìn)行完全,可以采用兩種方法:(1)原料配比中,使便宜原料過量以提高平衡時(shí)酯化率;(2)通過不斷蒸發(fā)去除反應(yīng)生成的酯和水。由于植物甾醇沸點(diǎn)高,可在反應(yīng)體系內(nèi)加入甲苯或者二甲苯,作為反應(yīng)溶劑和帶水劑,利用分水器去除反應(yīng)生成的水。但是考慮到甲苯和二甲苯對人體及環(huán)境存在一定的危害,所以采用過量α-亞麻酸既做反應(yīng)物又充當(dāng)反應(yīng)溶劑,在一定的真空度下去除反應(yīng)生成的水。

2.1.2 原料質(zhì)量比對酯化率的影響

表 1 不同催化劑催化合成α-亞麻酸植物甾醇酯的酯化率

采取添加α-亞麻酸過量來促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。在真空度為 0.03～0.04 MPa,催化劑用量為反應(yīng)原料質(zhì)量的 2%,反應(yīng)溫度 130℃,反應(yīng)時(shí)間為 7 h條件下,反應(yīng)原料質(zhì)量比對α-亞麻酸植物甾醇酯酯化率的影響如圖 1所示。從經(jīng)濟(jì)角度考慮,期望等物質(zhì)的量的反應(yīng)底物可以完全反應(yīng),但是在實(shí)際操作中這并不是理想的條件,當(dāng)?shù)任镔|(zhì)的量的α-亞麻酸和植物甾醇反應(yīng) 7 h后其酯化率只在 65%左右。

圖 1 原料質(zhì)量比對酯化率的影響

結(jié)果表明,隨著α-亞麻酸添加量的增大,酯化率迅速增大,當(dāng)α-亞麻酸 ∶植物甾醇質(zhì)量比為4∶1時(shí),酯化率達(dá)到最大值,再繼續(xù)增大α-亞麻酸添加量,酯化率反而降低。Villeneuve P.等[15]在研究植物甾醇油酸酯的合成時(shí),也發(fā)現(xiàn)了類似的情況。當(dāng)質(zhì)量比為5∶1和6∶1時(shí),酯化率反而下降。這種情況可以由硫酸氫鈉的催化機(jī)理來解釋。硫酸氫鈉催化酯化反應(yīng)機(jī)理是硫酸氫根電離出的氫離子極化羰基中的O,增強(qiáng)羰基 C受親核試劑進(jìn)攻的能力。隨著α-亞麻酸質(zhì)量的增加使得催化劑在整個(gè)體系中的濃度下降,氫離子無法很好的作用于羰基 O和 C,從而導(dǎo)致酯化率下降。另一方面,也有可能是α-亞麻酸發(fā)生了自身的縮合反應(yīng)而影響了酯化率。李瑞等[17]在利用有機(jī)相脂肪酶催化合成共軛亞油酸β-谷甾醇酯時(shí),當(dāng)酸醇物質(zhì)的量比為1∶1時(shí)酯化率達(dá)到最高,當(dāng)物質(zhì)的量比逐漸增大,酯化率呈遞減趨勢。故選擇原料質(zhì)量比為4∶1。

2.1.3 反應(yīng)溫度對酯化率的影響

在真空度為 0.03～0.04 MPa,原料質(zhì)量比為4∶1,催化劑用量為反應(yīng)原料質(zhì)量的 2%,反應(yīng)時(shí)間7 h,反應(yīng)溫度對α-亞麻酸植物甾醇酯酯化率的影響如圖 2所示。從圖 2可以看出,在溫度低于 100℃時(shí),酯化率很低,這主要是由于植物甾醇在 100℃以下不能熔融,無法與α-亞麻酸充分接觸,導(dǎo)致反應(yīng)遲緩;為了使反應(yīng)較快進(jìn)行,可預(yù)先加熱植物甾醇后再加入α-亞麻酸和催化劑。當(dāng)溫度高于α-亞麻酸后,產(chǎn)品的酯化率隨著溫度的升高而急速增加,但到了 130℃以后,酯化率增加的幅度變小,特別是從150℃增加到 180℃增加的幅度更小。升溫能提高反應(yīng)速率,但隨著溫度的升高,產(chǎn)品顏色逐漸加深,影響最終產(chǎn)品的應(yīng)用。陳茂彬等[21]在研究反應(yīng)溫度對合成植物甾醇油酸酯的影響時(shí),同樣發(fā)現(xiàn)當(dāng)反應(yīng)溫度大于 135℃以后,酯化率增加的幅度減小。α-亞麻酸含有三個(gè)雙鍵,如果反應(yīng)溫度過高容易被氧化,所以反應(yīng)溫度應(yīng)控制在 150℃以下為宜。

圖 2 反應(yīng)溫度對酯化率的影響

2.1.4 催化劑添加量對酯化率的影響

在真空度為 0.03～0.04 MPa,原料質(zhì)量比為4∶1,反應(yīng)溫度 130℃,反應(yīng)時(shí)間 7 h,催化劑用量對α-亞麻酸植物甾醇酯酯化率的影響如圖 3所示。由圖 3可見,隨著催化劑用量的增加,酯化率顯著增加,但超過 2%以后增加幅度變緩,并且隨著催化劑量的增加,產(chǎn)品顏色變深。硫酸氫鈉在催化植物甾醇油酸酯合成時(shí)也呈現(xiàn)相似的規(guī)律[21]。所以催化劑用量以底物質(zhì)量的 2%為優(yōu)。

圖 3 催化劑添加量對酯化率的影響

2.1.5 反應(yīng)時(shí)間對酯化率的影響

在真空度為 0.03～0.04 MPa,原料質(zhì)量比為4∶1,催化劑用量為反應(yīng)原料質(zhì)量的 2%,反應(yīng)溫度130℃,反應(yīng)時(shí)間對α-亞麻酸植物甾醇酯酯化率的影響如圖 4所示。很多研究發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時(shí)間越長,酯化率越高[15,17,21-23]。α-亞麻酸植物甾醇酯的酯化率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而升高,特別是在反應(yīng)開始的 8 h內(nèi)升高趨勢顯著;當(dāng)在繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間時(shí),升高趨勢趨于平緩。從經(jīng)濟(jì)角度考慮,反應(yīng)時(shí)間應(yīng)限制在一定的范圍內(nèi),反應(yīng)時(shí)間過長也可能導(dǎo)致副反應(yīng)的發(fā)生、副產(chǎn)物的生成,故最佳反應(yīng)時(shí)間選擇 8 h。

圖 4 反應(yīng)時(shí)間對酯化率的影響

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

為了探索各個(gè)因素對α-亞麻酸植物甾醇酯酯化率的影響,確定最佳工藝條件,根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,正交試驗(yàn)選擇原料質(zhì)量比 (α-亞麻酸:植物甾醇)、催化劑添加量、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度作為考察因素,采用正交試驗(yàn)法設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案 (見表 2)。正交試驗(yàn)結(jié)果見表 3。

通過表 3分析結(jié)果可見,影響酯化率的因素主次順序?yàn)?D>C>A>B,其中反應(yīng)溫度 (D)是影響酯化率最主要因素,由單因素試驗(yàn)結(jié)果也可知,溫度升高,有利于酯化反應(yīng)進(jìn)行,但是溫度不宜太高,因?yàn)闇囟冗^高可能會發(fā)生副反應(yīng),如雙鍵被氧化,甾醇分子內(nèi)脫水等,影響產(chǎn)品質(zhì)量。結(jié)果表明,反應(yīng)溫度選擇 140℃比較合適。其次,影響酯化率的因素為反應(yīng)時(shí)間 (C),延長反應(yīng)時(shí)間,有利于酯化反應(yīng)的進(jìn)行,但是在單因素試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn),再延長反應(yīng)時(shí)間酯化率的增加幅度變小,所以選擇 8 h為反應(yīng)時(shí)間。再次,原料質(zhì)量比 (A)對酯化率也有一定的影響,添加過量的α-亞麻酸能促使反應(yīng)的進(jìn)行,當(dāng)原料質(zhì)量比為 4 ∶1和 5 ∶1時(shí) ,極值沒有變化 ,考慮到經(jīng)濟(jì)性 ,選取4∶1為原料配比的最佳比例。催化劑添加量 (B)對酯化反應(yīng)的影響最小,當(dāng)催化劑添加量為 2.5%時(shí),酯化率較高。所以,綜合試驗(yàn)結(jié)果和工藝的經(jīng)濟(jì)可行性,選取條件A2B3C2D2時(shí)能得到具有高產(chǎn)率和低成本的工藝條件,即α-亞麻酸與植物甾醇的質(zhì)量比4∶1,催化劑量為 2.5%,反應(yīng)時(shí)間為 8 h,反應(yīng)溫度140℃。在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),得到酯化率為 (98.88±0.98)%。與陳茂彬等[21-22]優(yōu)化的植物甾醇油酸酯和植物甾醇硬脂酸酯的工藝條件相比,本試驗(yàn)所用α-亞麻酸較多,采用真空技術(shù)也可以使α-亞麻酸受到保護(hù),不易被氧化;同樣條件下,酯化率有所提高。

表 2 因素水平表

表 3 正交試驗(yàn)安排及試實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 α-亞麻酸植物甾醇酯的薄層色譜分離

按照 1.6方法對得到的α-亞麻酸植物甾醇酯粗產(chǎn)品進(jìn)行薄層色譜分離,結(jié)果顯示,分離效果良好,有新物質(zhì)α-亞麻酸植物甾醇酯的生成。其中,新生成的α-亞麻酸植物甾醇酯的顏色比α-亞麻酸和植物甾醇的顏色要深,表明通過直接酯化法得到的產(chǎn)品中含有較高含量的α-亞麻酸植物甾醇酯。α-亞麻酸植物甾醇酯的 Rf值為 0.90,與文獻(xiàn)報(bào)道相符[24]。

2.4 α-亞麻酸植物甾醇酯的核磁共振譜儀分析

由α-亞麻酸植物甾醇酯的 1H譜圖可知,分析樣品中含有烯氫 (δ=4.5～6.5)和芳?xì)?(δ=6～8),不含醛氫 (δ=9～10)、羥基氫 (δ=10～13)和烯醇?xì)?δ=11～16),說明樣品中不含有機(jī)酸、醛和烯醇。由13C譜圖可知,樣品中含有叔酯碳 (δ=60～75)而不含羧酸酯碳 (δ=155～175)、羧酸碳 (δ=160～185)和醛碳 (δ=175～205)。通過對樣品進(jìn)行核磁共振譜儀分析,結(jié)合前人研究可初步推斷α-亞麻酸與植物甾醇酯化的位點(diǎn)是在植物甾醇六元環(huán)的一個(gè)羥基碳上,酯化后,羥基碳轉(zhuǎn)變成叔酯碳;也進(jìn)一步證實(shí)了反應(yīng)產(chǎn)物為α-亞麻酸植物甾醇酯[19]。

3 結(jié)論

以植物甾醇與α-亞麻酸為原料,硫酸氫鈉為催化劑,在對α-亞麻酸植物甾醇酯合成單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用正交試驗(yàn)確定了無溶劑直接酯化法合成甾醇酯的最優(yōu)工藝條件;正交試驗(yàn)篩選出的最佳反應(yīng)條件為:真空度為 0.03～0.04 MPa,硫酸氫鈉添加量為 2.5%(底物質(zhì)量),α-亞麻酸與植物甾醇的質(zhì)量比為4∶1,反應(yīng)溫度 140℃,反應(yīng) 8 h,酯化率可達(dá) 98%;所得條件溫和易操作,且由于在整個(gè)工藝中無任何有機(jī)溶劑和有毒有害物質(zhì)的引入,是一種安全、無污染的食品級綠色工藝。

植物甾醇酯作為一種降膽固醇和降血脂的功能性食品添加劑,可以廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)中,但是其開發(fā)和應(yīng)用在我國才剛剛起步。α-亞麻酸植物甾醇酯作為一種新的甾醇酯產(chǎn)品,在得到切實(shí)可行的合成工藝后,下一步還需對其結(jié)構(gòu)特性和生物活性等方面進(jìn)行全面的研究。

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Synthesis of PhytosterolsLinolenate byDirect Esterification without Solvent

Zhang Pin Deng Qianchun Huang Qingde Huang Fenghong
(Institute ofOil Crop of CAAS,Wuhan 430062)

A method of synthesizing phytosterols linolenate by direct esterification of phytosterols andα -linole2 nic acid without solventwas studied.The influencing factorswere studied by single factor tests,such asmass ratio,catalyst dose,reaction time and temperature.Through orthogonal test,the opti mal synthetic conditions were con2 firmed as follows:vacuum 0.03～0.04 Mpa,mass ratio ofα -linolenic acid to phytosterols 4∶1,catalyst dose 2.5%of raw materialweight,reaction temperature 140℃,and reaction ti me 8h.Under these conditions,the degree of esterification is up to(98.88±0.984)%.The developed process for synthesizing phytosterols linolenate could be considered as green,safe and highly efficient.

phytosterol,α -linolenic acid,direct esterification,phytosterols linolenate

TQ645.9+8

A

1003-0174(2010)01-0055-06

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所所長基金(2007-17)

2009-01-23

張品,女,1984年出生,碩士,功能食品與生物活性物質(zhì)

黃鳳洪,男,1956年出生,研究員,博士生導(dǎo)師,油料加工與營養(yǎng)研究