施詠毅，羅敏清，毛 麗，盧神州

(1.蘇州市中醫(yī)院 骨科，江蘇 蘇州 215003；2.現(xiàn)代絲綢國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123；3.蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215021)

絲素蛋白/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料修復(fù)骨缺損研究

施詠毅1，羅敏清2，3，毛 麗2，3，盧神州2，3

(1.蘇州市中醫(yī)院 骨科，江蘇 蘇州 215003；2.現(xiàn)代絲綢國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123；3.蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215021)

為了探討絲素蛋白/羥基磷灰石(SF/HA)復(fù)合多孔支架材料的制備及其用于骨缺損的修復(fù)，采用超聲波凝膠干燥法制備了SF/HA復(fù)合材料；以脫膠繭絲為增強(qiáng)材料，水溶性淀粉為制孔劑，通過去離子水萃取法除去淀粉，制備了SF/HA多孔復(fù)合材料。對(duì)其孔隙率及抗壓強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)試，并將其植入兔股骨缺損處觀察修復(fù)的情況。SF/HA多孔復(fù)合材料的孔隙率接近75 %，孔徑尺寸分布約從幾微米到400 μm，并且孔隙之間相互貫通，其抗壓強(qiáng)度可達(dá)10 MPa以上，植入兔股骨缺損處未見引起骨組織明顯的炎癥反應(yīng)及骨壞死，術(shù)后12周發(fā)現(xiàn)基本修復(fù)骨缺損部位，而空白對(duì)照組沒有骨生成。SF/HA多孔復(fù)合材料可以滿足骨組織工程支架的基本要求，用于骨缺損的修復(fù)。

絲素蛋白；多孔；羥基磷灰石；機(jī)械性能測(cè)試；X光照片

骨缺損是骨科臨床常見的難癥之一，在應(yīng)用數(shù)量上骨移植已經(jīng)成為僅次于輸血的人體組織移植。組織工程化骨的應(yīng)用為骨缺損的治療帶來良好的前景，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為組織工程化骨制備的重點(diǎn)是組織工程支架材料的研制構(gòu)建。羥基磷灰石(HA)是人體骨組織的主要成分，具有良好的生物相容性、生物活性及骨傳導(dǎo)性[1]，已廣泛用于修復(fù)各類骨缺損，但由于易發(fā)生脆性斷裂、疲勞破壞及燒結(jié)后的不可降解性，長(zhǎng)期療效不盡人意。雖然HA納米化后生物力學(xué)性能及可降解性得到改善，但仍距骨組織工程支架材料的要求相差甚遠(yuǎn)。為了提高材料的力學(xué)性能及新骨的形成速度，采用不同性質(zhì)的材料進(jìn)行雜化以獲得具有新特性的雜化支架材料，成為當(dāng)前生物材料研究的熱點(diǎn)[2-3]。絲素蛋白材料強(qiáng)度高，免疫原性低，生物相容性好，適合于制備生物醫(yī)用材料[4]。但是單純的多孔絲素蛋白用于骨修復(fù)過程中誘導(dǎo)成骨較慢[5]。在制備復(fù)合多孔支架材料中，致孔劑的選擇是比較重要的，既在室溫下難溶于水，還要能容易去除，不能影響材料的生物相容性。因此考慮使用水溶性淀粉作為致孔劑。水溶性淀粉作為致孔劑的優(yōu)點(diǎn)是其在室溫下溶解速度緩慢，但是加熱后比較容易溶于水而去除，另外淀粉的生物相容性比較好，即使不能完全去除也不影響材料的生物相容性和生物降解性。絲素蛋白能夠在超聲波作用下快速凝膠化[6]，因此，本研究以淀粉為致孔劑，采用超聲波凝膠干燥法來制備絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合材料，探討淀粉的加入對(duì)復(fù)合材料機(jī)械性能及孔結(jié)構(gòu)的影響。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行植入兔股骨進(jìn)行骨缺損修復(fù)的探討。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 絲素蛋白/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料的制備

中國(guó)家蠶生絲或者繭絲置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05 %的Na2CO3溶液中，于98～100 ℃處理30 min，重復(fù)3次，脫去蠶絲中的絲膠。洗凈干燥后的純絲素纖維用CaCl2·CH3CH2OH·H2O(摩爾比1∶2∶8)三元溶劑，于(75±2)℃攪拌溶解，浴比1∶10，時(shí)間1 h。溶解后的混合溶液經(jīng)過透析、濃縮為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 %的絲素蛋白(SF)水溶液。納米HA的制備如文獻(xiàn)[7]所示，脫膠繭絲梳理后剪成2 mm備用。取新制備的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7 %的HA漿料，按質(zhì)量比HA∶SF＝2的比例加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 %的絲素蛋白水溶液中，按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)2 %加入脫膠繭絲，然后加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(相對(duì)于復(fù)合材料內(nèi)固體總質(zhì)量)的可溶性淀粉粉末，用JDY-900智能型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲振蕩至形成凝膠。凝膠放入60 ℃烘箱干燥定形，然后保持60 ℃加入去離子水溶解萃取出淀粉，每隔1 h換一次水，用碘液檢測(cè)直至淀粉被水萃取完全。樣品烘干備用。

1.2 復(fù)合材料的表征

孔隙率的測(cè)定[8]：選用一個(gè)比重瓶裝滿乙醇，稱其質(zhì)量W1；把質(zhì)量為Ws的樣品浸入乙醇中，脫氣，務(wù)必使乙醇充盈于多孔支架的孔中，然后再加滿乙醇,稱其質(zhì)量為W2；把浸滿乙醇的樣品取出后，剩余的乙醇與比重瓶稱其質(zhì)量W3。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定4次，取平均值：

樣品支架本身體積：Vs＝(W1－W2＋Ws)/ρ

樣品支架孔體積：Vp＝(W2－W3－Ws)/ρ

樣品支架孔隙率：ε＝Vp/(Vp＋Vs)＝(W2－W3－Ws)/(W1－W3)

樣品的表觀密度：ρ0＝Ws/Vs

抗壓強(qiáng)度的測(cè)定：INSTRON5566萬(wàn)能實(shí)驗(yàn)機(jī)測(cè)試壓縮性能，樣品尺寸：0.5 cm×0.5 cm×1 cm，測(cè)試速度：0.5 mm/min。

形貌觀察：用HITACHIS-570型掃描電子顯微鏡觀測(cè)多孔復(fù)合材料的形貌。

1.3 復(fù)合材料體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年雄性新西蘭兔24只，平均體質(zhì)量2.4 kg，由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～24 ℃，濕度40 %～60 %。

材料植入：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自其耳緣靜脈內(nèi)緩慢注射3 %的戊巴比妥鈉30 mg/kg。麻醉生效后，在右股骨髁外側(cè)做長(zhǎng)約2 cm切口，剝離并剪去植骨區(qū)骨膜，在股骨外側(cè)髁以慢速電鉆垂直于股骨干鉆孔，在股骨髁內(nèi)形成4.5 mm直徑、10 mm深度的松質(zhì)骨缺損,不打穿內(nèi)側(cè)髁骨皮質(zhì)。隨機(jī)抽取12只為實(shí)驗(yàn)組，于骨缺損區(qū)植入絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合多孔材料；另外12只為對(duì)照組不作任何植入。所有動(dòng)物逐層縫合皮下組織及皮膚，安爾碘消毒切口?；贾恍袃?nèi)外固定，常規(guī)條件下喂養(yǎng)觀察。

X光觀察：于術(shù)后第4、8、12周，每次隨機(jī)選取4只兔子麻醉后攝右后肢側(cè)位X線片，觀察骨缺損新骨生成情況，曝光條件為52 kV，5.6 mAs，0.2 s，將照片導(dǎo)入電腦后觀察。

組織學(xué)觀察，Masson染色[10]：實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物處死后, 取骨痂標(biāo)本，10 %福爾馬林固定，10 %的硝酸脫鈣7 d，水洗，15 %碳酸鋰溶液中和，常規(guī)酒精脫水, 浸蠟后石蠟包埋，行5 μm 連續(xù)切片，切片脫蠟入水；1 %桔黃G 10 mL＋90 mL苦味酸酶染30 min，水洗；蘇木精核染15 min，自來水沖洗2 min；復(fù)合液染(麗春紅＋酸性復(fù)紅)10 min，水洗；1 %磷鎢酸分化10 min，1 %亞甲藍(lán)染15 min；無水乙醇脫水；二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合材料的電鏡觀察

對(duì)于骨組織工程材料，其孔徑和孔隙率對(duì)于誘發(fā)成骨是有很大影響的。研究表明[9]，15～50 μm的孔可以誘導(dǎo)纖維組織的長(zhǎng)入，50～150 μm的孔則可刺激骨樣組織的生成，而150～500 μm的孔可以直接誘發(fā)礦化骨的生成。由圖1可見，隨著淀粉的加入，在復(fù)合材料中形成了較多的孔隙，孔徑也逐漸增加。另外由于淀粉的溶出，這些孔都是相通的，大孔的孔壁上還套著小孔。小孔只有幾微米而大孔可以達(dá)到幾百微米，滿足成骨的需要。隨著淀粉加入量從0 %增加到100 %，平均孔徑從20 μm增加到200 μm。其中最大孔徑已經(jīng)超過500 μm，隨著淀粉加入量的繼續(xù)增加，最大孔徑可能突破1 000 μm，但是這也會(huì)導(dǎo)致整個(gè)材料在脫淀粉后崩潰，無法成形。

圖1 加入不同淀粉量的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合材料的SEM照片(標(biāo)尺：600 nm，放大50倍)Fig.1 SEM Images of Surface of SF/HA Porous Composites with Different Starch Mass Fractions (Bar＝600 nm, ×50)

2.2 復(fù)合材料的表觀密度和孔隙率

從圖2中可以看出，隨著淀粉加入量從0 %上升到100 %，復(fù)合材料的表觀密度從0.86 g/cm3下降到0.52 g/cm3,而孔隙率從52 %上升到87 %。說明隨著淀粉加入量的增加，表觀密度有明顯的下降，而孔隙率有明顯的上升。

2.3 復(fù)合材料的抗壓性能

從圖3可以看到，隨著淀粉加入量從0 %上升到100 %，復(fù)合材料的抗壓強(qiáng)度從23 MPa下降到3.3 MPa,復(fù)合材料的抗壓模量從660 MPa下降到144 MPa，說明材料的抗壓性能隨著淀粉加入量的增加顯著下降，超過100 %的淀粉加入量，材料強(qiáng)度太小而無法成形。

理想的骨組織工程支架材料應(yīng)該具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，一般以小梁骨為參照，其抗壓強(qiáng)度應(yīng)大于5 MPa，抗壓強(qiáng)度大于10 MPa可認(rèn)為是合格的組織支架材料。因此本研究選擇加入50 %淀粉的復(fù)合材料，其抗壓強(qiáng)度達(dá)到10.3 MPa，抗壓模量為320 MPa，孔隙率為72 %，最大孔徑250 μm，作為植入兔股骨缺損的修復(fù)材料。

圖2 孔隙率和表觀密度隨淀粉加入量的變化Fig.2 Porosity and Apparent Density of SF/HA Composites with Different Starch Mass Fractions

圖3 抗壓強(qiáng)度和模量隨淀粉加入量的變化Fig.3 Compression Strength and Modulus of SF/HA Composites with Different Starch Mass Fractions

2.4 復(fù)合材料的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.4.1 大體觀察

動(dòng)物在材料植入后正?；顒?dòng)、進(jìn)食，患肢輕度腫脹，1周左右消退，切口無感染，植入材料均未見明顯排斥現(xiàn)象。4周時(shí)材料表面有薄層結(jié)締組織包膜形成；8周時(shí)材料表面骨化，與周圍組織界限模糊；12周時(shí)骨缺損處已填滿骨組織，顏色較周圍骨皮質(zhì)呈暗紅色，表面光滑，質(zhì)硬?？瞻讓?duì)照組骨缺損處始終無新骨長(zhǎng)入，由纖維結(jié)締組織填充，骨缺損邊緣發(fā)生硬化。

2.4.2 植入后X光觀察

由圖4可見，a圖為術(shù)后第4周，HA/SF植入的缺損區(qū)邊緣清楚，周邊骨端與材料間的間隙較明顯，材料影清晰；b圖為術(shù)后8周時(shí), 周邊骨端與材料間的間隙模糊，骨痂向移植物長(zhǎng)入，骨缺損區(qū)較前縮小，材料有降解現(xiàn)象；c圖為術(shù)后12周時(shí)，骨缺損部位鈣化程度進(jìn)一步加深, 整個(gè)材料骨密度增高；d圖為術(shù)后12周時(shí)，對(duì)照組骨缺損部位仍然未見明顯鈣化，呈低密度影，缺損區(qū)邊緣硬化。

圖4 植入后不同時(shí)期的X光照片(箭頭部分為骨缺損部位)Fig.4 The X-ray Pictures at Different Periods after Implant Operation (The Arrows are the Bone Defects)

2.4.3 組織學(xué)觀察

在Masson染色中，成熟骨中的I型膠原呈紅色，軟骨膠原是Ⅱ型膠原，呈綠色；而真皮、骨及鈣化軟骨中的膠原呈紅綠相間，鈣化軟骨中可以呈現(xiàn)較多紅染。幼稚骨組織中的膠原主要呈綠色，新生骨在成熟過程中呈綠色至紅綠相間，骨質(zhì)越成熟，紅染越多[10]。由圖5可見，a圖為術(shù)后4周時(shí)，HA/SF材料邊緣有纖維結(jié)締組織長(zhǎng)入，有少量纖維骨痂形成，可見到少量成纖維細(xì)胞，未見明顯成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞；Masson染色主要表現(xiàn)為綠色。b圖為術(shù)后8周時(shí),Masson染色出現(xiàn)較多的紅染，說明已經(jīng)發(fā)生成骨現(xiàn)象。c圖為術(shù)后12周時(shí)，Masson染色主要表現(xiàn)為紅綠相間,大部分部位形成新生骨組織。d圖為術(shù)后12周時(shí),對(duì)照組骨缺損處發(fā)生疤痕愈合，由致密結(jié)締組織填充，Masson染色均為綠色，無新生骨組織形成。

從體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，SF/HA復(fù)合材料生物相容性良好，沒有引起嚴(yán)重的免疫反應(yīng)或者嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸長(zhǎng)入多孔材料中，并且逐漸修復(fù)缺損部位。而對(duì)照組只有纖維疤痕組織的生成，沒有成骨。說明SF/HA復(fù)合材料能夠促進(jìn)骨缺損的愈合，可以作為骨組織工程支架材料使用。

圖5 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組不同時(shí)期的組織學(xué)觀察(Masson染色，100倍)Fig.5 Histological Observation of the Experimental Group and Control Group in Different Periods(Masson's Trichrome Staining, ×100)

3 結(jié) 論

1)使用超聲波凝膠干燥的方法，以脫膠繭絲為增強(qiáng)纖維、可溶性淀粉為致孔劑，成功制備了絲素蛋白/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料，進(jìn)行了復(fù)合材料修復(fù)兔股骨缺損的研究。

2)絲素蛋白/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料壓縮強(qiáng)度達(dá)到10 MPa以上，孔隙率達(dá)到70 %以上，孔徑尺寸分布約從幾微米到400 μm, 并且孔隙之間相互貫通。

3)兔股骨缺損植入修復(fù)實(shí)驗(yàn)表明，多孔復(fù)合材料生物相容性良好，術(shù)后12周能夠修復(fù)骨缺損部位，該材料有望作為一種骨修復(fù)材料得到應(yīng)用。

[1] KOKUBO Tadashi, KIM Hyun Min, KAWASHITA Masakazu. Novel Bioactive Materials with Different Mechanical Properties[J]. Biomaterials, 2003, 24(13):2161-2175.

[2] 呂彩霞，姚子華. 納米羥基磷灰石/殼聚糖-硫酸軟骨素復(fù)合材料的制備及其性能研究[J].復(fù)合材料學(xué)報(bào)，2007，24(1)：110-115.

[3] 廖建國(guó)，李玉寶，王學(xué)江，等.納米羥基磷灰石/聚碳酸酯復(fù)合生物材料Ⅱ：體外生物活性[J].復(fù)合材料學(xué)報(bào)，2008，25(3)：68-72.

[4] ALTMAN Gregory H, DIAZ Frank, JAKUBA Caroline,et al. Silk-based biomaterials[J]. Biomaterials, 2003, 24(3):401-416.

[5] MEINEL Lorenz, FAJARDOD Robert, HOFMANN Sandra,et al. Silk Implants for the Healing of Critical Size Bone Defects[J]. Bone, 2005, 37: 688-698.

[6] WANG X, KLUGE J A, LEISK G G, et al. Sonicationinduced Gelation of Silk Fibroin for Cell Encapsulation[J].Biomaterials, 2008, 29: 1054-1064.

[7] 盧神州，李明忠，白倫.羥基磷灰石/絲素蛋白納米復(fù)合顆粒的制備[J]. 絲綢，2006(2)：17-19.

[8] 肖秀峰，黃瓊瑜，劉榕芳，等.納米羥基磷灰石/聚合物多孔復(fù)合支架材料[J].復(fù)合材料學(xué)報(bào)，2008，25(6)：39-46.

[9] GREEN D,WALSH D, MANN S,et al.The Potential of Biomimesis in Bone Tissue Engineering:Lessons from the Design and Synthesis of Invertebrate Skeletons[J].Bone, 2002,30(6): 810-815.

[10] CHO S W,KIM I K,LIM S H,et al.Smooth Muscle-like Tissues Engineered with Bone Marrow Stromal Cells[J].Biomaterials, 2004, 25: 2979-2986.

Study on Porous Silk Fibroin/ hydroxyapatite Composites Used as Bone Defect Treatment

SHI Yong-yi1, LUO Min-qing2,3, MAO Li2,3, LU Shen-zhou2,3
(1. Orthopedics, Suzhou Traditional Chinese Medical Hospital, Suzhou 215003, China; 2. National Engineering Laboratory for Modern Silk, Suzhou 215123, China; 3. College of Textile and Clothing Engineering, Soochow University, Suzhou 215021, China)

To investigate the preparation and the bone defect treatment of the porous silk fibroin/ hydroxyapatite(SF/HA) scaffold composites, the porous composites of SF/HA were prepared by means of dried after sonication-induced gelation. In the process, degummed silk fiber was used as the reinforcement, and watersoluble starch was used as the porogen, which was removed by extraction method with deionized water. The porosity and compressive strength of SF/HA were tested. At the same time, changes of the bone histology were observed by implanting SF/HA into the bone defects of rabbits. The porosity ratio of SF/HA is about 75 % and the compressive strength can exceed 10 MPa. The diameter of the pores is about from several microns to four hundred microns and most of them are circular. The animal experiments show that SF/HA did not result in inflammatory reaction and bone putrescence. The bone defect was repaired by SF/HA composites by 12 weeks after implant operation. Whereas in the control group, by 12 weeks after operation, no callus formed and the defects were not repaired. It is suggested that SF/HA would be a potential scaffold composites for the treatment of bone defects.

Silk fibroin; Porosity; Hydroxyapatite; Mechanical testing; Radiography

TS149；TB332

A

1001-7003(2010)10-0001-04

2010-07-06；

2010-09-03

國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目(2005CB623906)；蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(SYJG0923)；江蘇省產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新資金項(xiàng)目(BY2009127)

施詠毅(1975－ )，男，主治醫(yī)師，主要從事脊柱外科、創(chuàng)傷骨科和人工骨的研究。通訊作者：盧神州，副教授，博士，lushenzhou@suda.edu.cn。