由 陽(yáng)，彭永臻，，王淑瑩，劉秀紅

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 市政環(huán)境工程學(xué)院，哈爾濱150090，youyang1979@sina.com.cn;2.北京工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與能源工程學(xué)院，北京100124)

多聚脂肪酸(PHA)、糖原和多聚磷酸鹽(poly-P)是強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)(EBPR)中聚磷菌(PAO)體內(nèi)的主要能量和物質(zhì)貯存方式，聚磷菌在厭氧條件下吸收廢水中的碳源，貯存PHA，分解體內(nèi)的多聚磷酸鹽，把正磷酸鹽釋放到水體中，釋放能量，分解糖原.在好氧狀態(tài)下，聚磷菌分解PHA 并釋放出能量，用以細(xì)胞合成和糖原積累，大量吸收水體中的正磷酸鹽，在體內(nèi)貯存多聚磷酸鹽顆粒［1］.可見(jiàn)，多聚磷酸鹽是PAO 體內(nèi)磷以及能量的貯存物質(zhì);PHA 為細(xì)胞生長(zhǎng)和糖原合成提供前體;糖原水解的過(guò)程中為脂肪酸轉(zhuǎn)化成PHA 提供還原力.因此，PHA、多聚磷酸鹽以及糖原的貯存能力是直接影響系統(tǒng)除磷性能的關(guān)鍵因素.準(zhǔn)確定量這3 種物質(zhì)對(duì)研究和評(píng)價(jià)強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)非常重要.

PHA 的測(cè)定分為提取和測(cè)定兩步［2-3］.測(cè)定有分光光度法和氣相色譜法兩種，其中分光光度法的靈敏度比氣相色譜法要低很多.糖原的定量方法包括把聚合物水解成葡萄糖和測(cè)定葡萄糖量?jī)蓚€(gè)步驟［4］.定量葡萄糖有高效液相色譜和化學(xué)分析兩種方法，其中高效液相色譜靈敏度高.正磷酸鹽的測(cè)定一般采用國(guó)標(biāo)方法.本研究將色譜法和化學(xué)分析手段相結(jié)合，對(duì)強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)內(nèi)的這3 種多聚物的測(cè)定方法進(jìn)行了優(yōu)化，試圖找到準(zhǔn)確快捷、在實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)單易行的測(cè)定方法.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 PHA 的測(cè)定

PHA 是在細(xì)胞質(zhì)中被一層膜物質(zhì)包圍的大約0.2 到0.5 μm 的顆粒［5］.在聚磷菌體內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)貯存的PHA 是一種典型的共聚物，這種共聚物主要由3-羥基丁酸(3HB)和3-羥基戊酸(3HV)單體組成，還有一少部分的3-羥基，2 烷基丁酸(3H2MB)和3-羥基，2-甲基戊酸(3H2MV).

本研究中PHA 測(cè)定采用的方法［6-7］為:從EBPR 反應(yīng)器中取得活性污泥后，按1%(體積分?jǐn)?shù))的比例與甲醛混合以抑制污泥中微生物的活動(dòng).混合液經(jīng)離心后上清液去除，然后以磷酸鹽混合液清洗樣品，再次離心后上清液再次去除.之后樣品在-36 ℃，0.076 mbar 下冷凍干燥(Labconco，American)脫水20 h.用天平(Mettler，Switzerland)稱(chēng)取凍干污泥30 mg 和PHB、PHV 標(biāo)準(zhǔn)品一起放入有膠塞并配有螺旋扣塑料帽的玻璃管中，加入2 mL 氯仿和2 mL 酸化甲醇酯化液(酯化液為含有4%，10%，20%硫酸的甲醇).緊緊密封蓋子后放入干式恒溫器(Sanyo，Japan)中，在100 ℃下消解2，4 或20 h.冷卻到室溫后加入1 mL 的純水(Millipore，American)，混合后劇烈震蕩以去除氯仿相中的殘?jiān)?靜沉1 h 以實(shí)現(xiàn)相的分離，然后以移液器(Gilson，F(xiàn)rance)吸出下層的氯仿相放入另一個(gè)小瓶中，以硫酸鈉干燥后，3 μL上色譜分析.PHB 和PHV 的標(biāo)準(zhǔn)樣品采用美國(guó)西格瑪公司產(chǎn)品(sigma，cat NO.81329，403105)，分別準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5，1，1.5，2，2.5，3.0 mg標(biāo)準(zhǔn)樣品放入消解瓶中，其他測(cè)定步驟跟污泥樣品測(cè)定相同，上氣相色譜分析后做得標(biāo)準(zhǔn)曲線PHB 為:y =221.529 0 x -95.518 3，回歸系數(shù)為0.999 15.PHV 標(biāo)線為:y=353.560 4 x+10.403 8，回歸系數(shù)為0.999 13.

氣相色譜(hp 6890N，American)配備HP INNOVAX 色譜柱(30 m length×320 μmID×0.25 μmfilm)，進(jìn)樣口溫度200 ℃，分流比為1∶25，氮 氣 做 載 氣，F(xiàn)ID 檢 測(cè) 器 工 作 溫 度 為250 ℃，爐溫采用程序升溫，150 ℃保持1 min，然后以10 ℃/min的速度升到250 ℃并保持1 min.

1.2 糖原的測(cè)定

糖原是一種分支狀的聚合體，它由葡萄糖單體以糖苷鍵連接而成.它的定量方法包括把聚合物水解成葡萄糖和測(cè)定葡萄糖量?jī)蓚€(gè)步驟.然而區(qū)別葡萄糖是糖原水解產(chǎn)生的還是其他碳?xì)浠衔锼猱a(chǎn)生的是不可能的，所以，目前大多研究都不是定量糖原，而是定量總碳水化合物.定量葡萄糖有高效液相色譜和化學(xué)分析兩種方法，其中高效液相色譜靈敏度高，但是對(duì)色譜柱的選擇和維護(hù)要求比較高，費(fèi)用很高.

本實(shí)驗(yàn)中糖原測(cè)定的前幾個(gè)步驟與PHA 測(cè)定的步驟相同，污泥樣品經(jīng)預(yù)處理，清洗，20 h 凍干后，準(zhǔn)確稱(chēng)量30 mg 放入帶膠塞和螺旋塑料蓋的玻璃瓶中.然后加入5 mL 0.4，0.6 或0.8 mol/L HCl，在恒溫培養(yǎng)箱(Sanyo，Japan)中100 ℃下消解1，3，5 或7 h，冷卻后以0.25 μm 的膜過(guò)濾.取樣品2 μL 以葡萄糖氧化酶法試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)測(cè)定樣品中的葡萄糖含量.

1.3 多聚磷酸鹽的測(cè)定

聚磷菌貯存在體內(nèi)的多聚磷酸鹽顆粒又叫做異染顆粒，它是由正磷酸鹽單體以酯鍵結(jié)合形成的線性或環(huán)形聚合物.多聚磷酸鹽的測(cè)定基本分為3 個(gè)步驟:1)樣品的干燥脫水.2)生物質(zhì)消解使多聚磷酸鹽顆粒轉(zhuǎn)化成正磷酸鹽.3)正磷酸鹽的測(cè)定.

本實(shí)驗(yàn)先測(cè)得反應(yīng)器上清液中正磷酸鹽質(zhì)量濃度，再使用純水清洗污泥樣品，采用凍干機(jī)干燥，準(zhǔn)確稱(chēng)量0.45 mg 后放入250 mL 錐型瓶中，加入100 mL 純水和40 mL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))過(guò)硫酸鉀溶液［8］，蓋塞包緊后放入壓力滅菌鍋(Sanyo，Japan)后于110，120 和130 ℃中分別加熱20，30，40 min，冷卻后移至250 mL 容量瓶中定容，取出少量以鉬銻抗光度法測(cè)定正磷酸鹽質(zhì)量濃度.污泥中聚磷的含量既為消解后正磷酸鹽與消解前正磷酸鹽濃度之差.試劑空白和標(biāo)準(zhǔn)溶液系列也經(jīng)同樣的消解操作.標(biāo)準(zhǔn)曲線為y =104.59x -0.015 9，回歸系數(shù)為R2=0.999 6.

本實(shí)驗(yàn)中利用的活性污泥樣品都來(lái)自于有PAOs 富集的、以丙酸為唯一碳源的EBPR 反應(yīng)器.富含PHB 的污泥采自SBR 反應(yīng)器厭氧階段末端，富含多聚磷酸鹽顆粒和糖原的污泥取自SBR 反應(yīng)器好氧階段末端.

2 結(jié)果與討論

2.1 PHA 的測(cè)定優(yōu)化

以不同酸化甲醇體積分?jǐn)?shù)提取PHB 的提取物結(jié)果見(jiàn)圖1.可以看出，PHB 的提取量受酸化甲醇體積分?jǐn)?shù)影響很大，4%的酸化甲醇取得了最大回收量.這個(gè)結(jié)果與很多研究是一致的［2］，另外，10%和20%酸化甲醇的樣品在大于10 h 消解時(shí)，提取物的量都有下降趨勢(shì)，這是由于過(guò)大的酸化甲醇體積分?jǐn)?shù)引起樣品中的3HB 片段的進(jìn)一步降解，產(chǎn)生了另外一些更簡(jiǎn)單的有機(jī)物，導(dǎo)致提取的PHB 的量減少.所以，4%的酸化甲醇體積分?jǐn)?shù)是最合適的.從圖中還可以看出，消解生物質(zhì)產(chǎn)生3HB 單體需要一定的反應(yīng)時(shí)間，在2 h 時(shí)，提取物的量很少，而當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到11 h 后，提取物的量有大幅度的提高，而4%酸化甲醇的樣品甚至在11 ～20 h 之間還有提高，這說(shuō)明足夠的反應(yīng)時(shí)間是必要的.雖然Adrian［2］等人認(rèn)為2 h 的反應(yīng)時(shí)間就可以提取細(xì)胞內(nèi)的大部分PHB，但是本研究經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明，只有達(dá)到充足的反應(yīng)時(shí)間才能達(dá)到最大的回收量.

圖1 不同消解時(shí)間提取PHB 的比較

以不同酸化甲醇體積分?jǐn)?shù)提取PHV 提取物的結(jié)果見(jiàn)圖2.

圖2 不同消解時(shí)間提取PHV 的比較

與PHB 相比，PHV 的提取受酸化甲醇體積分?jǐn)?shù)變化的影響不大，20%酸化甲醇的提取物在消解大于10 h 時(shí)，還是會(huì)有量的減少，這說(shuō)明在這個(gè)體積分?jǐn)?shù)下，PHV 也會(huì)發(fā)生降解.4%和10%酸化甲醇的樣品在消解20 h 時(shí)都能達(dá)到最大回收，所以，這兩個(gè)體積分?jǐn)?shù)比較適合提取PHV.同樣，PHV 的消解反應(yīng)需要至少11 h 的時(shí)間.

為了檢測(cè)4%的酸化甲醇和消解20 h 提取PHB、PHV 方法的準(zhǔn)確度，采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行考察.取5 份凍干后的污泥樣品放入消解瓶后再加入PHB 和PHV 純品，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表1 可知，以4%的酸化甲醇和消解20 h 來(lái)提取PHB 和PHV，準(zhǔn)確度很好，說(shuō)明這一方法的測(cè)量值接近于真值，系統(tǒng)誤差小，加標(biāo)回收率分別為98.6%～102.1%和97.1%～102.5%.

2.2 糖原的測(cè)定優(yōu)化

樣品經(jīng)預(yù)處理、凍干、消解成葡萄糖后，可以通過(guò)多種方法測(cè)定葡萄糖含量.國(guó)際上EBPR 系統(tǒng)糖原的測(cè)定多采用高效液相色譜法HPLC［9-10］.本研究初始階段試圖應(yīng)用配有C18柱(waters，American)的液相色譜(waters，American)分離葡萄糖，使用折光率檢測(cè)器，0.6 mL/min，0.004 mol/L H2SO4做流動(dòng)相，但經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，C18 柱無(wú)法把葡萄糖和消解液中的其他物質(zhì)分離開(kāi)，這可能是因?yàn)橄庖旱碾x子間力太強(qiáng)，阻礙了葡萄糖的分離.后期實(shí)驗(yàn)采用氧化酶法葡萄糖試劑盒［11］測(cè)定葡萄糖含量，在不同消解時(shí)間和鹽酸濃度下糖原的提取結(jié)果見(jiàn)圖3.

圖3 不同消解時(shí)間和鹽酸濃度下糖原的提取

從圖3 可以看出，消解時(shí)間對(duì)糖原的提取量影響很大，在相同HCl 濃度下，不同的消解時(shí)間下提取的糖原量有很大不同，以0.6 mol/L HCl為例，消解時(shí)間為1 h 回收到的糖原量為0.028 947 mg/mg，隨著消解時(shí)間不斷增加，回收到的糖原量也不斷增加，到消解5 h 時(shí)，回收量已經(jīng)達(dá)到0.105 3 mg/mg.但是繼續(xù)增加消解時(shí)間并不能進(jìn)一步增大回收量反而會(huì)由于樣品的進(jìn)一步消解導(dǎo)致葡萄糖回收量的減少.此外，消解HCl濃度對(duì)葡萄糖回收量的影響也很大，當(dāng)消解時(shí)間很短時(shí)，回收量會(huì)隨著HCl 濃度的增加而增加;當(dāng)消解時(shí)間為3 或5 h 時(shí)，回收量先增加再減少;而當(dāng)消解時(shí)間為7 h，回收量會(huì)隨著HCl 濃度的增加而減少.總體來(lái)說(shuō)，以0.6 mol/L 的鹽酸消解5 h 可以達(dá)到最大的葡萄糖回收量.

為了研究此方法的精密度，還進(jìn)行了精密度實(shí)驗(yàn)，取4 個(gè)污泥樣品，分別平行測(cè)定6 次，同時(shí)附空白，結(jié)果見(jiàn)表2.從表2 可知，當(dāng)取樣量控制在氧化酶法要求的線性范圍內(nèi)時(shí)所得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)都比較小，說(shuō)明測(cè)定值與它們的均值的差距較小，偶然誤差小，因而實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精密度較好.

2.3 多聚磷酸鹽顆粒的測(cè)定優(yōu)化

提取的聚磷酸鹽顆粒的量與不同消解時(shí)間和消解溫度的關(guān)系可見(jiàn)圖4，由圖可見(jiàn)，聚磷酸鹽顆粒的提取量受消解時(shí)間和溫度影響很大，過(guò)高的消解溫度(130 ℃)并不能顯著提高多聚磷酸鹽的提取效率，對(duì)于把磷酸鹽聚合物降解成正磷酸鹽這一反應(yīng)來(lái)說(shuō)，120 ℃的反應(yīng)條件已經(jīng)足夠，而110 ℃明顯不能使反應(yīng)充分進(jìn)行.同樣，足夠的反應(yīng)時(shí)間是必要的，20 min 不能使反應(yīng)完全，反應(yīng)基本是在30 min 時(shí)達(dá)到最大回收量，40 min 是多余的，因此，120 ℃，30 min 是消解多聚磷酸鹽顆粒的最佳反應(yīng)條件.

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 不同消解時(shí)間和消解溫度下聚磷的提取

為考察凍干污泥量與其相對(duì)應(yīng)的多聚磷酸鹽質(zhì)量濃度的相關(guān)性，分別取30 ～50 mg 的10 個(gè)樣品，測(cè)得多聚磷酸鹽質(zhì)量濃度，同與其對(duì)應(yīng)的取樣量進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表3.

整理表3 中的數(shù)據(jù)得出消解污泥量與消解液中P 含量之間存在相關(guān)性，含P 量y=0.101 x-0.042 6，相關(guān)性R2=0.994，可見(jiàn)消解污泥量x 與消解液中總P 量y 存在較好的相關(guān)性，本方法可行.

表3 消解污泥量與消解液中含P 量的分析結(jié)果 mg

3 結(jié) 論

1)對(duì)強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)胞內(nèi)聚合物的測(cè)定方法進(jìn)行了優(yōu)化，其中PHA 采用化學(xué)物質(zhì)提取，氣相色譜定量;多聚磷酸鹽顆粒采用過(guò)硫酸鉀氧化，抗壞血酸法測(cè)定;糖原采用稀鹽酸消解，葡萄糖試劑盒法比色測(cè)定.

2)經(jīng)過(guò)方法優(yōu)化和精密度、準(zhǔn)確度分析，4%酸化甲醇消解20 h 是提高PHA 回收量的最佳條件.糖原在0.6 mol/L HCl 條件下消解5 h 提取量最大.在120 ℃、氧化30 min 條件下多聚磷酸鹽顆?？梢宰畲蠡厥?

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