劉凌 龐纓 周旭紅 馮瑩 葉絮

(廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液科 廣東 廣州 510000)

自2005年James[1]首先報(bào)道在真性紅細(xì)胞增多癥(PV)患者中發(fā)現(xiàn)JAK2-V617F點(diǎn)突變以來,該基因目前已成為國際上研究的熱點(diǎn)。為了進(jìn)一步明確JAK2-V617F點(diǎn)突變?cè)诟鞣N血液病中的表達(dá)情況,建立簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、高效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法,為臨床診斷和治療提供幫助,筆者對(duì)我院血液科2007年6月至2008年6月門診及住院,確診為骨髓增殖性腫瘤(MPN)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、骨髓增生異常綜合征/骨髓增殖性腫瘤(MDS/MPN)、急性髓系白血病(AML)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的部分患者及正常對(duì)照共124例進(jìn)行JAK2-V617F檢測(cè),并報(bào)道如下。

1 對(duì)象及方法

1.1 研究對(duì)象

我院血液科2007年6月至2009年6月門診及住院確診的相關(guān)患者,PV組男性11例,女性21例,年齡32～83歲,中位年齡66.5歲。ET組男性8例,女性12例,年齡35～88歲,中位年齡69.5歲。IMF組男性1例,女性2例。MDS組男性14例,女性8例,年齡35～76歲,中位年齡48.0歲。MDS/MPN組男性5例,女性3例,年齡55～78歲,中位年齡62.0歲。AML組男性9例,女性5例,年齡25～75歲,中位年齡44.5歲。ALL組男性5例,女性5例,年齡23～45歲,中位年齡32.5歲。Bcr-abl陽性CML組男性3例,女性2例,年齡46～69歲,中位年齡53.5歲。10例健康志愿者對(duì)照。MPN、MDS、MDS/MPN、AML、ALL、CML診斷參照WHO相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[2]。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA制備 抽取患者和正常對(duì)照外周血5mL,按酚-氯仿法提取白細(xì)胞基因組DNA。用紫外分光光度儀檢測(cè)DNA的濃度和純度,取吸光度A260/A280介于1.6～1.8的標(biāo)本,DNA終濃度50～100mg/L,置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 采用AS-PCR法,設(shè)計(jì)2條正義引物F1、F2和一條反義引物R,引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。F1在野生型和突變型DNA中均可出現(xiàn),作為內(nèi)參照以保證反應(yīng)的精確度;F2為突變特異性引物,跨越G-T突變位點(diǎn)。F1序列為：5′-A T C T A T A G T C A T G C T G A A A G T A G G A G A A A G-3′;F2序列為：5′-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3′;R序列為：5′-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3′。反應(yīng)體系為：模板DNA2μL,反義引物R1.0μmol/L,正義引物F10.5μmol/L,F20.5 μmoL/L,10×PCRBuffer5μL,Mgcl21.2mmol/L,dNTP 各2 mmol/L,TaqDNA聚合酶2.5U(廣州萊德爾生物科技有限公司),去離子水25.5μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性11min,94℃變性30s,55℃30s,72℃30s,循環(huán)36次,72℃延伸6min。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 取5μLPCR產(chǎn)物經(jīng)20g/L瓊脂糖凝膠電泳后紫外光透視儀分析圖像、攝像并保存結(jié)果。出現(xiàn)364bp產(chǎn)物為野生型,出現(xiàn)364bp和243bp2條產(chǎn)物為突變型。

1.2.4 基因測(cè)序 對(duì)所有陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本均再次分別在與上述相同反應(yīng)體系和條件下,進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,由上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,將所得到的測(cè)序結(jié)果與野生型基因序列進(jìn)行對(duì)比,出現(xiàn)G-T突變?yōu)殛栃浴１容^直接測(cè)序結(jié)果與AS-PCR檢測(cè)結(jié)果的一致性。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以()表示,2組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率表示,率的比較用χ2檢驗(yàn),P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 AK2-V617F突變PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

出現(xiàn)364bp和243bp2條條帶為陽性,出現(xiàn)364bp一條條帶為陰性,見圖1。

2.2 JAK2-V617F突變?cè)诟鞣N疾病中的表達(dá)情況

(1)PV組陽性率為93.8%(30/32),ET組陽性率為60.0%(12/20),IMF組陽性率為0%(0/3),MDS組陽性率為4.5%(1/22),MDS/MPN組陽性率為12.5%(1/8),AML、ALL、CML患者及正常對(duì)照均為陰性。JAK2-V617F突變?cè)赑V、ET、MDS、MDS/MPN患者中的陽性率差異有顯著性(χ2=47.799,P<0.05)。(2)JAK2-V617F突變陽性ET患者的血紅蛋白均數(shù)為(198.6±27.1)g/L,與陰性患者血紅蛋白值均數(shù)201.5g/L相比,差異無顯著性(t=0.062,P>0.05)。(3)JAK2-V617F突變陽性ET患者的血小板均數(shù)(834.1±283.5)×109/L,與陰性患者血小板均數(shù)(826.3±228.8)×109/L相比,差異無顯著性(t=0.083,P>0.05)。(4)JAK2-V617F突變陽性PV和ET患者白細(xì)胞均數(shù)為(20.6±4.7)×109/L,與陰性患者白細(xì)胞均數(shù)(16.7±4.2)×109/L相比,差異有顯著性(t=2.44,P<0.05)。(5)骨髓活檢：根據(jù)Comori網(wǎng)硬蛋白染色結(jié)果,按網(wǎng)狀纖維積分標(biāo)準(zhǔn)(Manoharan改良法)[3],將PV及ET患者按照骨髓纖維組織增生程度分為(±)、(+)、(++)、(+++)及(++++)5組,JAK2-V617F突變陽性患者骨髓纖維組織增生較明顯,差異有顯著性(P<0.05),見表1。

2.3 基因測(cè)序結(jié)果

圖1 AS-PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

陽性標(biāo)本顯示為T峰,陰性標(biāo)本顯示為G峰,證實(shí)突變型DNA存在JAK2-V617F點(diǎn)突變,即JAK2基因12號(hào)外顯子第1849位核苷酸G被T所取代。AS-PCR法檢測(cè)出44例陽性,80例陰性。直接測(cè)序法檢出29例陽性,并同時(shí)為AS-PCR法檢出;另外95例陰性,其中15例用AS-PCR法檢測(cè)為陽性。2種方法檢測(cè)陽性率有顯著差異,AS-PCR法高于直接測(cè)序法(χ2=4.368,P<0.05)。2種方法所得結(jié)果之間存在正關(guān)聯(lián),關(guān)聯(lián)系數(shù)r=0.74,說明直接測(cè)序法陽性者AS-PCR法也趨向陽性,見表2。

3 討論

MPN是一組以骨髓髓系中一系或多系增殖為特征的克隆性造血干細(xì)胞疾病。迄今為止,人們對(duì)MPN的確切發(fā)病機(jī)制仍不十分明確,過去的診斷[4]主要依靠臨床表現(xiàn)、血常規(guī)、血清EPO水平、NAP積分、骨髓細(xì)胞形態(tài)和骨髓活檢等,并且必須排除繼發(fā)性因素。但有時(shí)仍難以與有相似癥狀和血象表現(xiàn)的其他疾病相鑒別,如繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥,反應(yīng)性血小板增多,類白血病反應(yīng),MDS等,給診斷造成一定困難,且治療上也無特異性藥物。James[1]首先報(bào)道了在PV患者中發(fā)現(xiàn)JAK2-V617F點(diǎn)突變,其后在MPN的其他亞型中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了該突變的存在,但陽性率不一。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)JAK2-V617F點(diǎn)突變?cè)赑V患者中陽性率最高,其次為ET患者,在AML、ALL、CML中為陰性,與國際上報(bào)道相符[5];在IMF患者中未發(fā)現(xiàn)陽性,可能與標(biāo)本數(shù)太少有關(guān)。

MDS是一組以髓系細(xì)胞分化和成熟異常、骨髓衰竭為特征的髓系腫瘤,伴有外周血細(xì)胞減少和紅系、粒系、巨核細(xì)胞系一系或多系形態(tài)學(xué)異常,由于遺傳不穩(wěn)定因而高風(fēng)險(xiǎn)向急性髓系白血病(AML)轉(zhuǎn)化[6]。近期研究發(fā)現(xiàn),有部分MDS某些亞型的患者中有JAK2突變,Coffer[7]等在通過對(duì)MDS患者發(fā)病機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)在MDS細(xì)胞凋亡機(jī)制中發(fā)揮重要的作用,是影響髓系祖細(xì)胞成熟障礙、調(diào)控MDS細(xì)胞凋亡的重要通路。本研究在MDS和MDS/MPN中各發(fā)現(xiàn)1例JAK2-V617F突變。Szpurka[8]研究57例MDS/MPN患者發(fā)現(xiàn)11例攜帶JAK2-V617F。這個(gè)發(fā)現(xiàn)意味著共同發(fā)生并不是偶然的,什么機(jī)制影響MDS患者獲得JAK2-V617F,或者JAK2-V617F陽性MPN發(fā)展為MDS？是否這種單一突變?cè)谌祟愔芯妥阋詫?dǎo)致MPN的發(fā)生？這些問題仍有待進(jìn)一步探討。

表1 PV和ET患者JAK2-V617F突變與骨髓纖維增生程度的關(guān)系

表2 直接測(cè)序法與AS-PCR法比較

本研究還發(fā)現(xiàn)ET患者中JAK2-V617F突變與血紅蛋白量、血小板數(shù)量無關(guān)。但國外有報(bào)道[9]ET患者中JAK2-V617F突變陽性者血紅蛋白量較高、血小板計(jì)數(shù)較低,故我們的研究還有待增加病例數(shù)以作進(jìn)一步分析。PV患者陰性例數(shù)太少,未做比較。PV和ET陽性患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于陰性患者,且骨髓纖維化程度亦較陰性者嚴(yán)重。國外學(xué)者[10]亦發(fā)現(xiàn)陽性患者中白細(xì)胞計(jì)數(shù)高,且可以作為獨(dú)立的危險(xiǎn)因素與血栓形成及骨髓纖維化成正相關(guān)。

JAK2-V617F的檢測(cè)目前有直接測(cè)序、BsaⅪ限制性酶切分析、AS-PCR和熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)等方法。直接測(cè)序法準(zhǔn)確率高但敏感度低,多應(yīng)用于科研;限制性酶切方法較復(fù)雜且陽性率不高;AS-PCR特異性強(qiáng)、敏感度高;RT-PCR敏感度高,且對(duì)于突變基因的含量及純合子、雜合子的比例能定量分析,但費(fèi)用較高。Baxter等[11]應(yīng)用AS-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ET中陽性率高達(dá)57%,明顯高于直接測(cè)序法僅12%的陽性率。由于MPN患者中只有一部分外周血粒細(xì)胞可能起源于惡性祖細(xì)胞,同時(shí)普通方法僅可在超過40%的細(xì)胞(等位基因>20%)有雜合子突變時(shí)才可檢測(cè)到,因此普通測(cè)序可能會(huì)低估攜帶JAK2-V617F突變的比例,應(yīng)用ASPCR方法可以在3%的細(xì)胞有雜合子突變就可檢測(cè)到。在我院臨床檢測(cè)中,測(cè)序陽性者與應(yīng)用AS-PCR方法檢測(cè)完全一致,但ASPCR靈敏度更高,且方法簡(jiǎn)便、成本較低,是值得廣泛開展的臨床檢測(cè)方法。

[1]James C, U go V , Couedic JPL , et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signaling causes polycythaemia vera[J].N ature,2005,434(7037):1144～1148.

[2]Vardiman JW, Harris NL, Brunning RD. The World Health Organization(WHO) classification of the myeloid neoplasms[J].Blood,2002,100:2292～2302.

[3]浦權(quán),楊梅如.血液病骨髓組織病理學(xué)彩色圖譜[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2000:4～21.

[4]Jaffe ES, Harris NL, Stein H,et al.World Health Organization Classification of Tumors Pathology and Genetics of Tumors of Heamatopoietic and Lymphoid Tissues IARC Press International Agency for Research on Cancer[J].Lyon: IARC Press,32～41.

[5]Kannim S, Thongnoppakhun W, Auewarakul CU.Two-round allele specific-polymerase chain reaction: a simple and highly sensitive method for JAK2-V617F mutation detection[J]. Clin Chim Acta,2009,401(1～2):148～151.

[6]肖志堅(jiān).骨髓增生異常綜合征:現(xiàn)況與問題[J].白血病淋巴瘤,2005,14:193～196.

[7]Lee J W, Kim Y G, Soung Y H, et al. The JAK2-V617F mutation in denovoacute myeloqenous leukemias[J]. Oncogene, 2006, 25(9):1434～1436.

[8]Szpurka H,Tiu R,Murugesan G,et al.Refractory anemia with ringed sideroblasts associated with marked thrombocytosis (RARS-T),another myeloproliferative condition characterized by JAK2 V617F mutation[J].Blood,2006,108(7):2173～2173.

[9]Heller PG, Lev PR, Salini JP, et al.JAK2 V617F mutation in platelets from essential thrombocy themia :corretation with clinical features and analysis of STAT3 phosphorylation status[J].Eur JHaematol,2006,77(3):210～216.

[10]Barosi G, Rosti V.Novel strategies for patients with chronic myeloproliferative disorders[J].Curr Opin Hematol,2009 Mar,16(2):129～134.

[11]Baxter EJ, Scolt LM, Campbell PJ, et al. Acqurired mutation of the tyrosine Kinase JAK2 in human myeloproliferative disorder[J].Lancet,2005,365(9464):1054～1061.