魏鎖成,鞏轉(zhuǎn)娣,宋昌軍

2.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,蘭州 730030

輪狀病毒(Rotavirus,RV)性胃腸炎是流行廣泛的人獸共患病,也是多種幼齡動物及嬰幼兒的一種急性腸道傳染病,以腹瀉和脫水為特征,病死率可達(dá)50%〔1〕。RV基因由11個不連續(xù)的dsRNA節(jié)段組成,其平均長度約為660～3 300bp,根據(jù)RV群抗原的不同及病毒 RNA末端指紋圖譜的分析,可將該病毒共分為A～G 7個群;根據(jù)其中和抗原VP7的差異可將A組輪狀病毒分為14個G型(G1～G14)及 21個 P 型(P1～P24)〔2-3〕。

結(jié)構(gòu)蛋白VP6是由基因組第6基因編碼的內(nèi)殼蛋白,占輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白總量的80%,全長基因?yàn)? 356bp,VP6具有很強(qiáng)的抗原性和免疫性,單克隆抗體證明,VP6能與所有RV株的抗體反應(yīng),VP6在不同血清型間高度保守(87%～99%)〔4-5〕,因此是劃分RV組和亞組的依據(jù)和抗RV理想的疫苗靶位,也是檢測到的主要抗原〔6-7〕。

目前尚無治療動物輪狀病毒腹瀉的特效藥物,疫苗是預(yù)防的主要手段〔8〕。雖然人輪狀病毒已有口服疫苗,但效力有待提高。鑒于此,本實(shí)驗(yàn)擬通過以MA104細(xì)胞分離RV,建立豬輪狀病毒(procine rotavirus,PRV)VP6基因的實(shí)時熒光定量PCR(FQPCR)檢測方法,以期為研發(fā)快速準(zhǔn)確的診斷試劑盒和新型疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 樣本的采集 在甘肅榆中和慶陽等地豬場采集腹瀉仔豬糞便樣本42份,于采集管中加入適量保護(hù)液,低溫冷藏。

1.1.2 細(xì)胞株和標(biāo)準(zhǔn)病毒株 羅猴腎細(xì)胞株(MA-104)蘭州百源基因生物技術(shù)公司惠贈,豬輪狀病毒參考株(AV-55)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.1.3 設(shè)備儀器 超低溫冰箱,日本三洋公司MDF-390 AT;J-25冷凍離心機(jī),Beckman Avanti;酶標(biāo)儀 spectraMAXM2e型,Molecular devices公司;培養(yǎng)箱(Heal Force)HF160W;倒置顯微鏡(OLYMPUS);PCR擴(kuò)增儀,垂直板凝膠電泳儀,高速離心機(jī),基因擴(kuò)增儀和培養(yǎng)箱等。

1.1.4 試劑及其培養(yǎng)基 輪狀病毒診斷試劑盒(ELISA法),蘭州生物制品研究所提供;胎牛血清和小牛血清,胰蛋白酶溶液,DMEM(高糖)培養(yǎng)基,MA-104細(xì)胞培養(yǎng)液,細(xì)胞維持液,病毒處理液,30%丙烯酰胺儲存液,EB染色液和膠洗脫液等。

1.1.5 引物的設(shè)計與合成 按照熒光定量PCR引物設(shè)計原則,利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計合成引物。引物合成由北京百泰克生物有限公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本檢測與處理 依照輪狀病毒診斷試劑盒(ELISA法)的說明檢測42份腹瀉仔豬的糞便樣本,酶標(biāo)儀測定OD450值。

對陽性樣本糞便用1×PBS(0.1mol/L)制成20%懸液,4℃3 000r/min,離心20min,取上清,再4℃,10 000r/min,離心30min。病毒懸液濾過除菌后,緩慢滴加濃度為400g/L的PEG6000,至終濃度70g/L,調(diào)節(jié)至pH 7.5,4℃冰箱過夜,即得到陽性處理樣品(+)。用相同方法制備陰性處理樣品(-),作為對照。

1.2.2 MA-104細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng) 培養(yǎng)液含10%小牛血清 +高糖 DMEM,于 37℃5%CO2孵箱,培養(yǎng)2～ 3d。

1.2.3 細(xì)胞接毒 取生長良好的MA-104細(xì)胞,用處理過的RV接種MA-104細(xì)胞,37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)2～3d,然后收集。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.2.4 病毒純化 將收集的細(xì)胞培養(yǎng)液,反復(fù)凍融3次,4℃3 000 r/min離心20 min,取上清液裝入透析袋,用蔗糖包埋透析,收集濃縮液,4℃,45 000r/min離心120 min,棄上清液。將沉淀用PBS重新懸浮,經(jīng)蔗糖不連續(xù)密度梯度45 000 r/min 4℃離心180min,收集折光性不同的病毒帶,用少量PBS稀釋,4℃,同樣離心120 min,收集沉淀用少量PBS重懸,即為初步提純的病毒。

1.2.5 病毒RNA抽提 將陽性、陰性仔豬糞便樣品移至1.5mL離心管中,10 000r/min,4℃,離心30min,收集的沉淀用200μ L DEPC-H2O 溶解,加入等體積 2%SDS+0.2mol/L NaAc,室溫下放置15min。加入 400μ L 酚-氯仿-異戊醇溶液,搖勻,8 000r/min,10min,取上層水相,按步驟重新抽提一次;再取上層水相(約 200μ L)并加入500μ L無水乙醇和 70μ L 3mol/L NaAc,置 -70℃2h以上。于4℃13 000r/min,離心30min,棄乙醇,收集沉淀。1.2.6 病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄 采用20μ L反應(yīng)體系,在 Eppendorf管中依次加入：陽性模板RNA2μ L,Oligo(DT)181μ L,無 RNA 酶去離子水9μ L,Buffer 4μ L,dNTP Mix 2μ L,RNAse Inhibitor 1μ L,AMV 1μ L,混勻,37℃反應(yīng) 60min 后,70℃反應(yīng)10min。對陰性樣品用相同方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.7 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 采用 25L反應(yīng)體系,在Eppendorf管中依次加入：模板cDNA(陽性、陰性 各 1 份)1μ L,PCR 緩沖 液 2.5μ L,dNTP 0.2μ L,上 、下游引 物各 0.2μ L,Taq DNA 聚合酶0.125μ L,ddH2O 19.0μ L。進(jìn)行 PCR：72℃7min;95℃25s,51℃ 30s,72℃ 30s,35個 循 環(huán);95℃5min。

1.2.8 聚丙烯酰胺凝膠電泳 將純化、干燥后的陽性樣品RT-PCR產(chǎn)物,加入100μ L ddH2O溶解后,再進(jìn)行電泳。先將丙烯酰胺 2 700L,TBE 1 000L,H2O 6 300μ L,過硫酸銨 70μ L,TEMED 10μ L 溶液混勻,倒入電泳槽內(nèi),室溫下放置待完全凝固,放入電泳槽中,用TBE沖洗加樣孔。在其中一孔中加入Marker,另取陽性和陰性PCR產(chǎn)物各10μ L分別和非變性上樣緩沖液10μ L,混勻后分別移至加樣孔中電泳;用凝膠成像儀拍照、觀察,檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.9 熒光定量PCR(FQ-PCR)方法檢測 用熒光染料SyB配制熒光PCR反應(yīng)體系,將配制好的熒光PCR體系混勻后分裝于1、2、3和4號管中,每管16μ L,對應(yīng)加入4μ L 模板樣品,終體積201(注：1號管加入陽性樣品PCR產(chǎn)物;2號管加入10倍稀釋后的陽性樣品PCR產(chǎn)物;3號管加入為陰性樣品PCR產(chǎn)物;4號管加入 4μ L ddH2O作為空白,以排除非特異型擴(kuò)增及假陽性。)實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)條件與普通PCR相同,即：95℃,5min;35循環(huán)(95℃,5s;51℃,30s;72℃,30s)。觀察熒光曲線。

1.2.10 引物設(shè)計與合成 根據(jù)VP6基因序列同源性比對結(jié)果,結(jié)合寡核苷酸引物設(shè)計原則,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物。見表1。

表1 用于RV VP6基因檢測的引物Table 1 The synthesized primer used for detecting VP6 gene

1.2.11 FQ-PCR法與ELISA法結(jié)果比較 用本實(shí)驗(yàn)建立的FQ-PCR法測定采集的糞便樣本,其結(jié)果與輪狀病毒診斷試劑盒(ELISA法)得結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 糞便樣本的檢測 42份腹瀉豬糞便樣本OD450值的測定,判斷出編號為9、11、14、23和29號樣本為陽性,檢出率為11.91%。

2.2 病毒培養(yǎng)、分離 取陽性糞樣5份分別接種MA 104細(xì)胞,接毒后傳代18h出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(CPE),細(xì)胞膜縮融合、細(xì)胞層裂開、出現(xiàn)細(xì)胞核固縮,空泡化、染毒的細(xì)胞出現(xiàn)大片脫落區(qū)域,最后細(xì)胞死亡脫落。隨傳代次數(shù)增加,病變程度加深,CPE出現(xiàn)時間加快。結(jié)果分離到 1株輪狀病毒。見圖 1、2。

2.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及產(chǎn)物的驗(yàn)證 先進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增,驗(yàn)證引物的特異性。從陽性糞便樣本中提取RNA,以此為模板,結(jié)果得到約1 200bp的條帶表明產(chǎn)物與預(yù)期條帶相符(圖3)。將回收、純化、干燥后的陽性樣品PCR產(chǎn)物,重復(fù)PCR反應(yīng),結(jié)果見圖4。

2.4 核苷酸序列測定及同源性比較 經(jīng)對分離的輪狀病毒株VP6核苷酸序列測定,得到約1 200bp的VP6片段,與豬輪狀病毒參考株(AV-55)的同源性達(dá)88.50%。初步確定為豬豬輪狀病毒(PRV),暫命名為GS01毒株。

2.5 實(shí)時定量PCR檢測 實(shí)時熒光定量PCR(FQ-PCR)的結(jié)果(見圖5)表明,陰性樣品與空白對照的熒光均為直線,而陽性樣品熒光曲線在15個循環(huán)后明顯上升,且曲線升高的幅度與模板濃度呈正比。

圖5 實(shí)時定量PCR曲線圖Fig.5 Curve of FQ-PCR for porcine rotavirus

2.6 FQ-PCR法測定結(jié)果及比較 對52份樣本檢測,發(fā)現(xiàn)5份陽性糞樣,與ELISA法相同,但FQPCR法的靈敏度比普通PCR高數(shù)十倍。FQ-PCR比普通PCR和ELISA法更有優(yōu)勢。

3 討 論

3.1 豬輪狀病毒的MA-104細(xì)胞培養(yǎng)特性 細(xì)胞分離培養(yǎng)是研發(fā)輪狀病毒疫苗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是,由于RV表面的VP4能抑制病毒在細(xì)胞中的生長,因此輪狀病毒在一般組織培養(yǎng)中不能適應(yīng),需選用特殊的細(xì)胞株培養(yǎng),多數(shù)研究認(rèn)為MA-104細(xì)胞是動物RV生長最適宜的細(xì)胞〔9〕,因此我們選用了該細(xì)胞系。

此外,有研究〔10〕表明,在接種病毒后轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)易出現(xiàn)CPE,但我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),采用靜置培養(yǎng),出現(xiàn)CPE的時間及CPE的程度與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)結(jié)果無太大的區(qū)別,即靜置培養(yǎng)完全可以達(dá)到一般實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡囊?這與王鵬雁等(2002)〔11〕和蘇小庚(2005)〔12〕的報道一致。也與魚軻等(2007)用牛腎原代細(xì)胞培養(yǎng)輪狀病毒的效果相似〔13〕。

Vp6蛋白作為RV重要的組抗原和亞組抗原,用抗Vp6抗體的間接免疫熒光法能準(zhǔn)確地檢測輪狀病毒抗原,為病毒在組織和細(xì)胞中的定位檢測帶來方便,對于病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖與組裝的研究具有指導(dǎo)意義。Vp6蛋白在病毒感染的早期就開始合成,并在細(xì)胞質(zhì)中呈彌散分布,隨著感染時間的增加(12h后),Vp6蛋白主要以顆粒狀分布于細(xì)胞核四周,大部分參與了病毒顆粒的組裝〔14〕,這也可以解釋細(xì)胞病變的時間是在接毒傳代后18后出現(xiàn)。

3.2 分離株的同源性 本實(shí)驗(yàn)對ELISA檢測試劑盒測定的5份陽性糞樣分別接種MA-104細(xì)胞,CPE達(dá)到90%時收毒,分離到1株輪狀病毒。且對分離的病毒株純化、VP6核苷酸序列測定,得到1 200個核苷酸序列片段,與豬輪狀病毒參考株(AV-55)的同源性達(dá)88.5%,初步確定為豬豬輪狀病毒(PRV)。

3.3 熒光定量PCR與條件的優(yōu)化 我們在建立了犬輪狀病毒檢測方法的基礎(chǔ)上〔15〕,建立的FQ-PCR快速檢測方法,其靈敏度比普通PCR高數(shù)十倍,且熒光定量PCR具有引物和探針雙重保證。因此,無論從檢測靈敏度、特異性,還是抗污染、省時省力方面,FQ-PCR比普通PCR和ELISA技術(shù)更有優(yōu)勢。熒光定量PCR技術(shù)的關(guān)鍵是設(shè)計好特異引物和探針,而該引物和探針應(yīng)位于靶序列的高度保守區(qū)。只有這樣,設(shè)計的引物和探針才能避免漏檢。

目前將FQ-PCR用于檢測動物 RV的研究少見。Pang等以SYBR Green I染料提供熒光信號,針對 RV NSP3進(jìn)行檢測〔16-17〕。本實(shí)驗(yàn)也用SYBR Green I為熒光染料,以 RV保守序列VP6基因?yàn)閿U(kuò)增靶標(biāo),建立了實(shí)時PCR法。熒光染料的優(yōu)勢在于能監(jiān)測各種雙鏈DNA序列的擴(kuò)增,無需設(shè)計探針,方法簡便,成本低廉。

盡管有文獻(xiàn)報道,大多數(shù)情況下可以將優(yōu)化的普通PCR條件直接用于熒光定量PCR,但實(shí)驗(yàn)表明,熒光定量PCR與傳統(tǒng)PCR一樣,也需要進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化〔18-19〕。

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