孫永林，楊瑞

（襄樊學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北襄樊，441053）

芹菜（Apium graveolens）別名藥芹或水芹，為傘形花科植物芹菜的全草，具有平肝降壓、利尿消腫、養(yǎng)血補(bǔ)虛、防癌抗癌等功效[1]?？墒秤貌糠譃槠淙赓|(zhì)直立的葉柄，葉片往往作為廢棄物被扔掉。葉片中含有豐富的天然葉綠素資源，但天然的葉綠素著色力低，在光、熱、氧氣、pH值等變化時(shí)穩(wěn)定性差，通過稀酸分離的方法可除去其卟啉環(huán)中心的鎂，形成脫鎂葉綠素，用銅取代鎂后可獲得對(duì)光穩(wěn)定的衍生物葉綠素銅鈉，該衍生物具有補(bǔ)血、造血、活化細(xì)胞、抗菌消炎、抑制癌細(xì)胞生成等功效[2]。為了充分利用資源，減少?gòu)U棄物對(duì)環(huán)境的污染，我們對(duì)芹菜葉的葉綠素及葉綠素銅鈉的提取工藝進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

芹菜，購(gòu)于609菜場(chǎng)。試驗(yàn)儀器有UV-1900紫外-可見分光光度計(jì)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、水浴鍋、燒杯、錐形瓶、量筒、玻璃棒、漏斗等。試驗(yàn)試劑有氫氧化鈉、硫酸銅、無(wú)水乙醇、95%乙醇、石油醚、丙酮等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

①葉綠素的提取 將新鮮的芹菜葉洗凈、晾干并剪成適當(dāng)大小的碎片，分批投入沸水中燙漂1 min，不斷攪拌，迅速取出，用去離子水沖洗3遍，濾干水分。用紗布包好后，再用不同濃度的乙醇常溫浸泡過夜，浸提后在波長(zhǎng)為630 nm處測(cè)定提取液的吸光度，比較不同濃度乙醇的浸提效果[3]。通過單因素原則分別探討浸提時(shí)間和料液比的最佳工藝。

②皂化 浸提完畢，將浸提液過濾，使之與葉分離，將所得溶液移入燒杯中，加入5%NaOH調(diào)節(jié)pH值至一定范圍，然后將溶液轉(zhuǎn)入圓底燒瓶中，70℃水浴加熱回流，此時(shí)葉綠素發(fā)生皂化反應(yīng)生成葉綠素鎂鈉[4]。考察皂化pH值和時(shí)間對(duì)皂化效果的影響。

表1 乙醇濃度對(duì)葉綠素提取效果的影響

表2 料液比對(duì)葉綠素提取效果的影響

表3 浸提時(shí)間對(duì)葉綠素提取效果的影響

③酸化銅代 取下層皂化液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至一定值，加20%CuSO4水浴加熱，有葉綠素銅酸逐漸析出。用40～50℃熱水和40%的乙醇溶液反復(fù)洗滌3次以除去過量CuSO4和其他可溶性雜質(zhì)，減壓抽濾，沉淀即為粗葉綠素銅酸，成鹽后加水定容至50 mL，然后在波長(zhǎng)630 nm處測(cè)定產(chǎn)品吸光度，確定銅代最佳工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度的選擇

取芹菜葉5 g，用20 mL各種濃度的乙醇分別提取葉綠素，一定時(shí)間后在波長(zhǎng)為630 nm處測(cè)定提取液的吸光度，結(jié)果見表1。由表1可知，95%乙醇提取效果最好，吸光度為2.709。

2.2 料液比的選擇

取芹菜葉5 g，分別用不同比例的95%乙醇提取葉綠素，一定時(shí)間后在波長(zhǎng)為630 nm處測(cè)定提取液的吸光度，結(jié)果見表2。由表2可知，料液比為1∶9時(shí)提取效果最好。

2.3 浸提時(shí)間的選擇

取芹菜葉5 g，用45 mL 95%乙醇提取葉綠素，每隔2 h在波長(zhǎng)為630 nm處測(cè)定提取液的吸光度[5]，結(jié)果表明（表3），浸泡8 h時(shí)提取效果最好。

2.4 pH值和時(shí)間對(duì)皂化效果的影響

皂化是否徹底與溫度和加堿量有關(guān)，在一定的溫度下保持回流狀態(tài)，加堿量由pH值衡量。pH值、時(shí)間對(duì)皂化效果的影響見表4。

皂化效果通過加入石油醚觀察石油醚層的顏色來判斷，如呈綠色，表示皂化不完全；呈黃色，表示皂化完全。試驗(yàn)結(jié)果表明，在70℃回流的條件下，影響皂化效果的主要因素是加堿量?？刂苝H值在11～12，時(shí)間30 min即可皂化完全。

2.5 酸化銅代

在酸性條件下，葉綠素中的鎂離子易被銅離子取代。當(dāng) pH 值＞5時(shí)，會(huì)生成 Cu（OH）2沉淀，使 Cu2+濃度下降而影響銅代反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)pH值＜2時(shí)又會(huì)降低葉綠素銅鈉的穩(wěn)定性。因此銅代反應(yīng)的pH值宜控制在2～5。采用L9正交試驗(yàn)組合表進(jìn)行優(yōu)選試驗(yàn)，酸化銅代反應(yīng)試驗(yàn)因素、水平如表5所示，結(jié)果見表6。

從表6中R值分析可知，銅代時(shí)間是主要影響因素，而CuSO4加入量和pH值次之，溫度的影響最小，綜合分析得出，酸化銅代的最佳條件是：A2B1C2D3，即反應(yīng)溫度為75℃、回流時(shí)間為90 min、CuSO4的加入量為理論值的2倍、pH值為2～3。

2.6 成鹽

將粗葉綠素銅酸用40～50℃熱水和40%的乙醇溶液反復(fù)洗滌3次以除去過量CuSO4和其他可溶性雜質(zhì)，再用丙酮溶解沉淀，邊攪拌邊緩慢加入5%NaOH乙醇溶液調(diào)節(jié)pH值至11，此時(shí)有沉淀生成，靜置10 min，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌，置烘箱中烘干，便得到綠黑色有金屬光澤的葉綠素銅鈉粉末。

表4 pH值和時(shí)間對(duì)皂化效果的影響

表5 酸化銅代反應(yīng)正交試驗(yàn)因素水平

3 小結(jié)與討論

通過以上試驗(yàn)說明，芹菜葉制取葉綠素銅鈉鹽的最佳工藝條件為：將5 g芹菜葉剪碎，用95%乙醇浸提，料液比為1∶9，浸提時(shí)間為8 h。加堿皂化的pH值為11～12。酸化銅代的pH值為2～3，溫度為75℃，CuSO4的加入量為理論值的2倍，反應(yīng)時(shí)間1.5 h。粗葉綠素銅酸用40～50℃熱水過濾，再用無(wú)水乙醇洗滌，干燥即得產(chǎn)品。

表6 銅代反應(yīng)正交試驗(yàn)結(jié)果

[1]高金燕，曾小花，王毅輝，等.從西芹中提取黃酮類物質(zhì)的初步研究[J].中國(guó)食品添加劑，2004（3）：19-21.

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[3]徐美奕，關(guān)雄泰，許學(xué)軍.甘蔗葉制取葉綠素銅鈉鹽的研究[J].食品工業(yè)科技，2002，23（1）：59-60.

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[5]金長(zhǎng)明，楊愛玲.甜菜葉制取葉綠素銅鈉鹽的工藝研究[J].食品工業(yè)科技，1995（2）：17-19.