蔣瑜，張麗芳，朱維賢，李珂

（昆明市農(nóng)業(yè)科學研究院，云南昆明，650213）

馬鈴薯是世界四大作物之一，由于馬鈴薯具有適應(yīng)性強、產(chǎn)量高、營養(yǎng)成分全和產(chǎn)業(yè)鏈長等特點，受到全世界的重視。但馬鈴薯在種植過程中容易通過昆蟲媒介、摩擦接觸感染病毒，馬鈴薯主要又是以塊莖進行無性繁殖，這樣病毒為害逐年加重，使馬鈴薯種薯退化，產(chǎn)量下降。馬鈴薯莖尖分生組織培養(yǎng)是解決馬鈴薯退化的最有效的方法，它是根據(jù)病毒在植株體內(nèi)分布不均勻性即越靠近新生組織部位（如莖尖和根尖頂端生長點、新生芽的生長錐等處）病毒含量越少的原理，結(jié)合使用鈍化病毒的熱處理方法，通過剝?nèi)∏o尖分生組織進行培養(yǎng)獲得脫毒植株。本文研究了添加不同激素的培養(yǎng)基和莖尖大小對馬鈴薯莖尖成活及脫毒效果的影響，以期得到合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)出脫毒效果較好的核心苗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

由國際馬鈴薯中心提供的編號為B13-6未脫毒的種薯在昆明市農(nóng)業(yè)科學研究院繁殖的無菌馬鈴薯組培苗莖尖為試材。

無菌馬鈴薯組培苗啟動培養(yǎng)基配方：MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+肌醇100 mg/L。莖尖培養(yǎng)基配方：①MS+GA30.2 mg/L+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L；②MS+GA30.2 mg/L+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L；③MS+GA30.2 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L；④ MS+GA30.1 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+KT 0.5 mg/L；⑤MS+GA30.1 mg/L+KT 0.04 mg/L；⑥MS+GA30.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+泛酸鈣 0.2 mg/L+肌醇100 mg/L。以上培養(yǎng)基均添加食用白糖30 g/L，瓊脂 6 g/L，pH 值為 5.8。

1.2 培養(yǎng)條件

溫度：25～30℃，光照：2 000～3 000 lx，光照時間：10～12 h/d。

1.3 無菌馬鈴薯組培苗的獲得

將B13-6的薯塊洗凈進行打破休眠和催芽處理，當薯塊頂芽生長至1～2 cm后，放入37℃的恒溫箱中進行30 d的熱處理，拿出將芽采下用自來水沖洗干凈，再在超凈工作臺上用無菌水漂洗2～3次后，用0.1%的升汞消毒12～15 min，最后用無菌水漂洗4～5次，用消毒好的解剖刀切去芽的底部放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d左右后可長出苗，用長出的苗進行擴繁培養(yǎng)，得到無菌馬鈴薯組培苗，培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。

1.4 培養(yǎng)方法

在接種室內(nèi)的超凈工作臺上，把已繁殖好的無菌馬鈴薯組培苗莖尖放在解剖鏡下，用已經(jīng)消毒好的解剖針一層一層地剝離葉片，直到最后暴露出圓滑生長點時，用另一根消毒好的解剖針小心切取0.2～0.5 mm大小帶1～2個葉原基的莖尖，然后將其分別接種于1，2，3，4，5，6 號培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)室進行培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

將馬鈴薯莖尖接種于6種不同培養(yǎng)基上，且所切莖尖大小不同，從表1可看出，幾種培養(yǎng)基中6號培養(yǎng)基可直接成苗不形成愈傷組織，是較適宜的培養(yǎng)基；其次是5號培養(yǎng)基，但要先形成愈傷組織，后長成苗，且苗少；4號培養(yǎng)基也要先形成愈傷組織，后長成苗，且苗較少；其余的培養(yǎng)基不能成苗，不適宜莖尖脫毒培養(yǎng)。

表1 不同培養(yǎng)基對莖尖生長的影響

表2 剝離大小對莖尖生長的影響及脫毒效果

從表2可看出，帶1個葉原基莖尖的脫毒效果較好，但培養(yǎng)天數(shù)長，成苗困難；而帶2個葉原基的脫毒效果不好，但培養(yǎng)天數(shù)短，成苗容易一些。

3 小結(jié)與討論

3.1 材料的選取

試驗表明同一個品種個體之間在病毒感染程度上有很大的差異，所以進行莖尖分生組織培養(yǎng)之前，所選的材料必須是表現(xiàn)典型的本品種特性的植株，且植株生長健壯，無明顯的病毒性、真菌性、細菌性病害癥狀，單株產(chǎn)量和大薯率高，收獲后要選擇符合品種特性的薯塊作為外植體繁殖無菌馬鈴薯組培苗，以提高脫毒效果。由于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒病（PSTV）在目前用植物莖尖分生組織方法很難脫掉，在進行莖尖剝離脫毒前，應(yīng)先對入選的塊莖進行PSTV檢測，淘汰帶有PSTV的薯塊。

本試驗是利用無菌馬鈴薯組培苗進行莖尖脫毒，而不是用薯塊所發(fā)芽尖消毒后直接剝離。通過試驗可看出用無菌馬鈴薯組培苗進行莖尖脫毒更易操作，且污染小，可用的莖尖量大，容易得到脫毒苗。

3.2 培養(yǎng)基的配比

通過本試驗可看出，培養(yǎng)基中所加激素的種類及多少對培養(yǎng)效果有很大的影響。在本試驗中最適合的培養(yǎng)基是6號，其次是5號培養(yǎng)基，而用6號培養(yǎng)基進行脫毒培養(yǎng)時可直接成苗，用5號培養(yǎng)基進行脫毒培養(yǎng)時要先產(chǎn)生愈傷組織，然后才長成苗，而脫毒苗如果通過愈傷組織這一過程容易產(chǎn)生變異，所以最適合的培養(yǎng)基是6號，但6號培養(yǎng)基培養(yǎng)效果也不是太理想，還需要進一步試驗，以便找到更適合的培養(yǎng)基。

通過本試驗還可看出，培養(yǎng)基中使用食用白糖也可培養(yǎng)出苗，可代替蔗糖，以減少培養(yǎng)成本。

3.3 對薯塊的處理

薯塊是在地下，所以表面較臟，如果直接用其萌發(fā)的芽繁殖苗容易污染，而將薯塊洗凈后發(fā)芽繁殖無菌苗可降低污染率，得到更多的無菌苗。脫毒材料在進行莖尖組織剝?nèi)∏?，?yīng)進行材料的熱處理，以鈍化病毒的活性，消除馬鈴薯卷葉病毒，提高脫毒效果。把入選的馬鈴薯塊莖進行打破休眠和催芽處理，當薯塊頂芽生長至1～2 cm后，轉(zhuǎn)入恒溫箱內(nèi)進行37℃的高溫處理6～8周。通過對薯塊進行熱處理可提高脫毒效果。

3.4 切取莖尖應(yīng)注意的事項及莖尖的大小

切取莖尖時應(yīng)注意以下幾點：①剝離葉片時用一根解剖針，當暴露出圓滑生長點時再使用另一根解剖針切，這樣可以減少葉片上所帶的病毒感染生長點的幾率；②切取生長點時應(yīng)少帶一些莖稈組織部分，因為莖桿組織中帶有大量的病毒，這樣會降低脫毒率；③切取生長點時不要損傷到生長點，如果生長點受損就不可能長成苗。

莖尖的大小直接影響成苗的時間、成苗率及脫毒效果。莖尖越小其培養(yǎng)時間越長，成苗率也越低；莖尖越大，其培養(yǎng)時間相對較短，成苗率也相對較高；而最后的脫毒效果是莖尖越小脫毒的成功率越高。要綜合考慮這2個因素。

3.5 病毒檢測

由莖尖分生組織培養(yǎng)獲得的小苗，經(jīng)第1次擴繁后要對其進行嚴格的病毒檢測，以確定材料的脫毒情況。一般采用指示植物鑒定法、電鏡檢測法或抗血清鑒定法，經(jīng)病毒檢測后，確認是不帶病毒的株系，才能進一步利用，對帶病毒的株系應(yīng)淘汰或進行再次脫毒。

[1]盧翠華，石瑛，陳伊里.馬鈴薯生產(chǎn)實用技術(shù)[M].哈爾濱：黑龍江科學技術(shù)出版社，2003：154-157.

[2]孫茂林，謝世清，何云昆，等.云南薯類作物的研究和發(fā)展[M].昆明：云南科技出版社，2003：152.

[3]李副生，楊生超，楊清輝，等.植物組織培養(yǎng)與甘蔗腋芽快繁[M].昆明：云南科技出版社，2002：75-77.

[4]齊恩芳，王一航，張武，等.馬鈴薯莖尖脫毒培養(yǎng)方法優(yōu)化研究[J].中國馬鈴薯，2007，21（4）：200-203.