莊童琳，李 虎，郭鳳霞，孫中濤

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.泰安嘉元生物工程公司，山東泰安271000；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安271018）

黑曲霉固態(tài)混菌發(fā)酵蘋果渣生產(chǎn)多酶生物飼料

莊童琳1，李 虎2，郭鳳霞1，孫中濤3，*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.泰安嘉元生物工程公司，山東泰安271000；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安271018）

蘋果渣是一類產(chǎn)量巨大而目前尚未充分利用的農(nóng)業(yè)廢棄物資源，其綜合利用不僅可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益，而且還可以減少環(huán)境污染，具有顯著的社會效益。本文采用兩株黑曲霉對蘋果渣進行固態(tài)混菌發(fā)酵生產(chǎn)多酶生物飼料，同時提高蛋白質(zhì)與氨基酸含量，改善其營養(yǎng)價值。研究結(jié)果表明，采用蘋果渣棉粕1∶1（w/w）、（NH4）2SO41%（w/w）、KH2PO40.1%（w/w）為最佳培養(yǎng)基，黑曲霉F2與F3最佳配比為2∶1（w/w），接種量0.4%（w/w），30℃恒溫培養(yǎng)48h，蛋白酶和纖維素酶活力分別為3674U/g和1207U/g，果膠與單寧的降解率分別為99.0%和66.1%，同時，蛋白質(zhì)與氨基酸的含量提高，可溶性糖含量降低，營養(yǎng)價值得到全面的改善。

蘋果渣，多酶生物飼料，抗?fàn)I養(yǎng)因子，蛋白酶，纖維素酶

我國每年在蘋果加工過程中排出蘋果渣約100多萬t，目前僅有25%～30%用于肥料、燃料、飼料或其他用途，而70%～75%因無法利用而廢棄，幾天內(nèi)就腐爛變質(zhì)發(fā)出酸臭味，嚴重污染環(huán)境［1］。美國、印度等其它國家情況也基本類似［2］。因此，蘋果渣的綜合利用引起了國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。目前，最可行的蘋果渣綜合利用方法是作為反芻動物的飼料，但以下幾個因素嚴重制約著其應(yīng)用效果：第一，蘋果渣中蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等含量很低，營養(yǎng)水平較低；第二，蘋果渣中果膠、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量較高，直接影響動物的攝食量和飼料的消化利用率；第三，蘋果渣中低分子糖類含量較高，會在動物瘤胃中發(fā)酵產(chǎn)氣，引起胃脹噯氣等不適。因此，直接飼用時效果欠佳［3］。國內(nèi)外許多學(xué)者采用微生物發(fā)酵的方式對蘋果渣的飼用價值進行改良，普遍采用的微生物是酵母菌類和絲狀真菌，擔(dān)子菌等大型真菌也有報道，但其研究目標都集中于提高蘋果渣的蛋白質(zhì)含量，沒有涉及抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解與低分子糖類的轉(zhuǎn)化［1，4-6］。其實，微生物對蘋果渣的發(fā)酵過程中，在菌體生長的同時，會產(chǎn)生大量的水解酶類，對果膠、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子進行一定程度的降解。水解酶類的分泌水平與抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解程度取決于微生物種類與發(fā)酵方式。本文采用兩株酶系互補的黑曲霉對蘋果渣進行固態(tài)混菌發(fā)酵生產(chǎn)多酶生物飼料，以酶系組成與酶活力水平為指標對生產(chǎn)工藝進行了優(yōu)化，同時對果膠與單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子的生物降解、低分子糖類的轉(zhuǎn)化、蛋白質(zhì)與氨基酸含量的提高水平等進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黑曲霉F1、F2（Aspergillus niger F1、F2） 系從長期堆積的蘋果渣中分離獲得，具有較高的纖維素酶產(chǎn)量，適合以蘋果渣為原料進行生長繁殖；黑曲霉F3（Aspergillus niger F3）、米曲霉 F4（Aspergillus oryzae F4） 由山東信德利生物工程公司提供，具有較高的蛋白酶產(chǎn)量；蘋果渣 煙臺紅富士蘋果榨汁后所得殘渣；棉粕 棉籽浸油后所得到的殘渣，蘋果渣與棉粕粉碎后，收集粒度為30～50目的組分備用；果膠、木聚糖 購自Sigma公司；基礎(chǔ)培養(yǎng)基 取蘋果渣與棉粕的混合物（1∶1，w/w）15g，裝入250mL三角瓶，121℃濕熱滅菌20min，自然冷卻；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

1.2.1 培養(yǎng)方法 向培養(yǎng)基中以0.5%（w/w）的接種量接入黑曲霉孢子，30℃恒溫培養(yǎng)48h，于24、36h各搖瓶一次，發(fā)酵完畢，置于通風(fēng)干燥箱中50℃干燥24h，磨碎，過80目篩，備用。

1.2.2 單因素實驗設(shè)計 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，采用不同的菌株組合與配比進行固態(tài)發(fā)酵實驗，然后測定各種酶的酶活力，以確定最佳菌株組合與配比。采用不同配比的蘋果渣與棉粕混合物為培養(yǎng)基，以0.5%（w/w）的接種量接入黑曲霉F2與F3（2∶1，w/w）進行固態(tài)混菌發(fā)酵，然后測定各種酶活力，以確定蘋果渣與棉粕的最佳配比。在此基礎(chǔ)上，按干料的1%（w/w）分別添加不同的無機氮源，發(fā)酵后測定各種酶活力，以確定最佳無機氮源的種類。

1.2.3 正交實驗設(shè)計 為確定培養(yǎng)基含水量、裝料量、（NH4）2SO4與K2HPO4等因素對產(chǎn)酶的影響及其最佳水平，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的正交實驗對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，其因素與水平見表1。以0.5%（w/w）的接種量接入黑曲霉F2與F3（2∶1，w/w）進行固態(tài)混菌發(fā)酵，然后測定各種酶活力。實驗不設(shè)空白列，每組實驗做3個平行，重復(fù)2次，以重復(fù)實驗誤差作為方差分析的實驗誤差。

1.2.4 接種量、溫度與pH等發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響采用所優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基進行單因素實驗，僅改變接種量，于30℃培養(yǎng)48h，以確定最佳接種量；采用所確定的最佳接種量，僅改變培養(yǎng)溫度或基質(zhì)的pH，以確定最佳培養(yǎng)溫度與pH。固態(tài)基質(zhì)的pH調(diào)節(jié)比較困難，本實驗采用鹽酸或氫氧化鈉對基質(zhì)的pH進行調(diào)節(jié)，基質(zhì)的自然pH約為5.0。

表1 正交實驗因素與水平表

1.2.5 發(fā)酵時間對菌體生長與酶活力的影響 采用所優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵條件進行固態(tài)發(fā)酵。每隔12h取出3瓶，于50℃干燥24h，混合均勻，然后測定干曲酶活力和干重減重。

1.2.6 分析方法 蛋白酶活力測定采用福林法［7］，在40℃、pH5.0的條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量為1個蛋白酶活力單位，以U/g干曲表示。纖維素酶活力測定采用DNS顯色法［8］，在40℃、pH5.0的條件下，1h水解羧甲基纖維素產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個纖維素酶酶活單位，以U/g干曲表示。果膠酶活力測定采用DNS顯色法［9］，在40℃、pH5.0的條件下，1min分解果膠產(chǎn)生1mmol半乳糖醛酸所需的酶量為一個果膠酶酶活單位，以U/g干曲表示。木聚糖酶活力測定采用DNS終止法［10］，在40℃、pH5.0的條件下，每分鐘水解木聚糖生成1mmol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位，以 U/g干曲表示。甘露聚糖酶活力測定采用DNS終止法［11］。在40℃、pH5.0的條件下，每分鐘水解角豆膠生成1mmol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位，以U/g干曲表示。單寧酶活力測定采用比色法［12］，在40℃、pH5.0的條件下，每分鐘水解1mmol單寧所需的酶量為一個酶活力單位，以 U/g干曲表示。

果膠含量的測定采用重量法［13］，單寧含量的測定采用K3Fe（CN）6法［14］，自由棉酚的測定采用間苯三酚比色法［15］。可溶性糖的測定采用 DNS比色法［16］，粗蛋白與精蛋白的測定采用凱氏定氮法［17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種及其配比對產(chǎn)酶的影響

（1）薇甘菊頸盲蝽PmGSTd1是屬于GST delta家族的一個分泌蛋白，與溫帶臭蟲（Cimex lectularius）GST的親緣關(guān)系最近。

如圖1所示，不同的菌種組合與配比對酶系組成與酶活力影響很大，F(xiàn)1菌株單獨發(fā)酵時纖維素酶活力最高，可達1495U/g，但蛋白酶活力很低；F3菌株單獨發(fā)酵時蛋白酶活力最高，可達3681U/g，但纖維素酶活力很低。與單菌發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵時的蛋白酶與纖維素酶活力都不是最高的，但酶系組成得到了改善，其中以黑曲霉F2與黑曲霉F3以2∶1（w/w）的比例混菌發(fā)酵所產(chǎn)生的蛋白酶與纖維素酶的活力均較理想，且總酶活力最高。因此，本研究選定黑曲霉F2與黑曲霉F3（2∶1，w/w）作為最佳菌種組合與配比。

2.2 蘋果渣與棉粕配比對產(chǎn)酶的影響

如圖2所示，蘋果渣與棉粕配比為3∶7（w/w）時，蛋白酶產(chǎn)量最高；而配比為5∶5（w/w）時，纖維素酶活力最高。如果僅考慮酶活力，蘋果渣與棉粕的最佳配比是4∶6（w/w），但棉粕價格遠高于蘋果渣，且飼料中纖維素酶等NSP酶的活力往往是限制性因素，因此，綜合考慮酶系組成與原料成本，我們采用5∶5（w/w）作為最適配比。

表2 正交實驗結(jié)果及其極差與方差分析

圖1 菌種及其配比對蛋白酶與纖維素酶酶活力的影響

圖2 蘋果渣與棉粕配比對蛋白酶與纖維素酶酶活力的影響

2.3 無機氮源對產(chǎn)酶的影響

如圖3所示，添加不同種類的無機氮源均可提高干曲的酶活力，其中以（NH4）2SO4效果最好。（NH4）2SO4與NH4NO3對蛋白酶的影響達到了顯著水平（P＜0.05），而NaNO3與NH4Cl的影響并不顯著（P＞0.05）；（NH4）2SO4與NH4Cl對纖維素酶的影響達到了顯著水平（P＜0.05），而NaNO3與NH4NO3的影響并不顯著（P＞0.05）。

2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化正交實驗

圖3 無機氮源對產(chǎn)酶的影響

正交實驗結(jié)果與分析如表2所示，極差分析結(jié)果表明，蛋白酶生產(chǎn)的最佳培養(yǎng)基組合為A2B2C2D1，纖維素酶生產(chǎn)的最佳培養(yǎng)基組合為A2B2C2D2。方差分析表明，因素A與B對兩種酶產(chǎn)量的影響均十分顯著（P＜0.01），其最佳水平均為第二水平；因素C對蛋白酶與纖維素酶影響不顯著；因素D對蛋白酶影響十分顯著（P＜0.01），最佳水平均為D1，對纖維素酶影響顯著（P＜0.05），最佳水平為D2。綜合考慮各因素對兩種酶影響的顯著程度，我們采用A2B2C1D1為最佳培養(yǎng)基組合，即蘋果渣與棉粕（1∶1，w/w）的初始含水量55%（w/w），（NH4）2SO41%（w/w）、K2HPO40.1%（w/w）、裝料量 15g干料/ 250mL三角瓶。

2.5 接種量、溫度、pH等發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響

分別以不同的接種量、培養(yǎng)溫度與pH做單因素實驗，結(jié)果見表3。接種量為0.4%（w/w）時，兩種酶的產(chǎn)量最高。27℃培養(yǎng)時，蛋白酶的酶活力最高，但與30℃培養(yǎng)時的酶活力并無顯著差異（P＞0.05）；30℃培養(yǎng)時，纖維素酶的酶活力最高，且與27℃培養(yǎng)時的酶活力差異顯著（P＜0.05），因此，我們采用30℃為最適培養(yǎng)溫度。蛋白酶與纖維素酶的培養(yǎng)基最適初始pH均為5.0。

表4 多酶飼料的酶系組成

表3 接種量對產(chǎn)酶的影響

表4 溫度對產(chǎn)酶的影響

表5 初始pH對產(chǎn)酶的影響

2.6 發(fā)酵時間對菌體生長與酶活力的影響

固態(tài)發(fā)酵的菌體生長量不能直接測定，但菌體生長量與基質(zhì)干重減少量呈正相關(guān)，因此，可用基質(zhì)干重減重來間接反映菌體的生長情況［18］。實驗結(jié)果見圖4，圖中蛋白酶與纖維素酶的100%相對酶活力分別為3393U/g與1454U/g。結(jié)果表明，前12h，菌體生長處于延遲期，基質(zhì)干重減重甚微，幾乎沒有蛋白酶與纖維素酶產(chǎn)生；12～36h為菌體的快速生長期，在其前期（12～24h）蛋白酶與纖維素酶有少許產(chǎn)生，在其中后期（24～36h）兩種酶大量產(chǎn)生；36～48h是菌體生長的減速期，此階段兩種酶仍然大量生成；48h后菌體生長緩慢，雖然此后酶活力仍然在緩慢增加，但考慮到48h后孢子大量產(chǎn)生，不利于產(chǎn)品性狀，因此，最佳發(fā)酵時間為48h。

圖4 發(fā)酵時間對菌體生長與酶活力的影響

2.7 多酶飼料的酶系組成

如表4所示，所生產(chǎn)的多酶飼料酶系比較豐富，除纖維素酶與蛋白酶外，還有果膠酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶與單寧酶存在。蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等有助于提高飼料中蛋白質(zhì)、纖維素與半纖維素等營養(yǎng)成分的消化利用率。果膠與單寧是植物源飼料中普遍存在的抗?fàn)I養(yǎng)因子，多酶飼料中的果膠酶與單寧酶有助于分解這些抗?fàn)I養(yǎng)因子，消除其抗?fàn)I養(yǎng)作用，有利于提高飼料的消化利用率。

2.8 發(fā)酵前后可溶性糖、蛋白質(zhì)與氨基酸含量的變化

由表5可知，發(fā)酵后基質(zhì)的可溶性糖含量大幅度下降，蛋白質(zhì)與氨基酸含量大幅度提高，粗蛋白與精蛋白含量分別提高40.8%與34.7%，氨基酸總量與必需氨基酸含量分別提高46.8%與71.7%，其中蛋氨酸、賴氨酸與蘇氨酸的含量分別提高83.6%、51.3%與98.7%，這標志著飼料的營養(yǎng)價值大幅度提高。

果膠與單寧是蘋果渣中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子，發(fā)酵過程中果膠與單寧被微生物降解，降解率分別達到99.0%與66.1%。棉酚是棉粕中存在的最主要抗?fàn)I養(yǎng)因子，在濕熱滅菌與發(fā)酵過程中，自由棉酚與蛋白質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)化為結(jié)合棉酚，失去了毒性［19］，發(fā)酵后，自由棉酚含量由最初的357μg/g下降到23μg/g，遠低于國家規(guī)定的飼料中自由棉酚含量的安全標準（100μg/g），因此，采用棉粕作氮源是安全的。

表5 發(fā)酵前后基質(zhì)營養(yǎng)成分的變化

3 結(jié)論

采用兩株黑曲霉對以蘋果渣和棉粕為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行固態(tài)混菌發(fā)酵生產(chǎn)多酶生物飼料，通過單因素實驗和正交實驗得到最佳發(fā)酵條件：蘋果渣與棉粕比例為1∶1（w/w），（NH4）2SO41%（w/w），KH2PO40.1%（w/w），黑曲霉 F2與 F3最佳配比為 2∶1（w/w），接種量0.4%（w/w），pH5.0，30℃恒溫培養(yǎng)48h。在最佳發(fā)酵條件下，產(chǎn)生多種水解酶類，其中蛋白酶和纖維素酶活力分別為3674U/g和1207U/g；果膠與單寧的降解率分別為99.0%和66.1%；蛋白質(zhì)與氨基酸的含量提高，可溶性糖含量降低。實驗證明黑曲霉固態(tài)混菌發(fā)酵對蘋果渣的綜合利用是一個有效的生物轉(zhuǎn)化方式，在產(chǎn)生多種水解酶類、提高蛋白質(zhì)含量的同時，降解蘋果渣中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，改善飼料的飼用價值。這種黑曲霉固態(tài)混菌發(fā)酵體系，同樣也適用于其它水果皮渣等類似農(nóng)業(yè)廢棄物的綜合利用。

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Production of bio-feed enriched of enzymes from apple pomace in solid state fermentation by Aspergillus niger

ZHUANG Tong-lin1，LI Hu2，GUO Feng-xia1，SUN Zhong-tao3，*
（1.College of Life Sciences and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Tai’an Jiayuan Biotechnology Limited Company，Tai’an 271000，China；3.College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China）

The objectives of this work were to produce bio-feed enriched of enzymes，biodegrade pectin and tannins，the main anti-nutritional factors in apple pomace，and to improve the nutritional level of the fermented substrate.Activities of proteinase and cellulase were 3674U/g and 1207U/g，and the biodegradation rates of pectin and tannins were 99.0%and 66.1%，respectively，when the optimum medium，the mixture of apple pomace and cottonseed powde（r1∶1，w/w），supplemented with 1%（w/w）（NH4）2SO4and 0.1%（w/w）KH2PO4，was inoculated with 0.4%（w/w）of Aspergillus niger F2 and F3（2∶1，w/w）and incubated at 30℃for 48h in solid state fermentation. The utilization of apple pomace in the paper was the most efficient biological treatment and could become a model for the value addition of similar wastes.

apple pomace；multienzyme bio-feed；anti-nutritional factor；proteinase；cellulase

TS255.1

A

1002-0306（2010）12-0171-05

2009-11-04 *通訊聯(lián)系人

莊童琳（1984-），女，碩士研究生，研究方向：植物資源利用。

山東省科技攻關(guān)計劃（2005GG1109002）。