李一婧，王廷璞，馬偉超，張文科

（天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅天水741001）

黑曲霉產(chǎn)殼聚糖發(fā)酵工藝的優(yōu)化

李一婧，王廷璞，馬偉超，張文科

（天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅天水741001）

通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)對黑曲霉產(chǎn)殼聚糖的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為：70mL玉米漿，4%葡萄糖，1.2%硫酸鎂，8.0×108孢子量，pH7.4～7.6，轉(zhuǎn)速為130r/min，29℃發(fā)酵72h的殼聚糖的產(chǎn)率最高，達(dá)到18%。

黑曲霉，殼聚糖，優(yōu)化

殼聚糖（chitosan）為甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物，是一種天然的生物高分子線形多糖，它是迄今為止唯一發(fā)現(xiàn)的陽離子動物纖維和唯一的堿性多糖［1］。在自然界中，甲殼素廣泛存在于低等植物菌類、藻類的細(xì)胞，節(jié)肢動物蝦、蟹、蠅蛆和昆蟲的外殼，貝類、軟體動物（如魷魚、烏賊）的外殼和軟骨，高等植物的細(xì)胞壁等，每年生物合成的資源量高達(dá)100億t，是地球上僅次于植物纖維的第二大生物資源，其中海洋生物的生成量在10億t以上，可以說是一種用之不竭的生物資源。如果將甲殼素中的乙?；摮?，則得到溶解性大大改善的殼聚糖［2］。殼聚糖在提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗自由基、強(qiáng)化肝功能、降血糖、降血壓、降低血脂調(diào)節(jié)膽固醇方面具有明顯的作用［1］。另外，殼聚糖可作為固定化載體，其具有機(jī)械性能良好、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、耐熱性強(qiáng)、細(xì)胞毒性極低、親和性好、安全性高等優(yōu)點(diǎn)。此外，其在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、飼料添加劑、紡織方面、造紙工業(yè)、化妝品工業(yè)和環(huán)保等領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用［2-6］。殼聚糖的制取通常采用化學(xué)法［5］，然而化學(xué)法生產(chǎn)殼聚糖耗能大、污染嚴(yán)重，并且生產(chǎn)的殼聚糖相對分子質(zhì)量及脫乙酰度不均一，殼聚糖的脫乙酰度和乙酰基的分布對其物理化學(xué)性質(zhì)和生物活性均有較大的影響［7］。此外，由于原料蝦殼或蟹殼不易收集且原料的質(zhì)量不能保證穩(wěn)定，時(shí)間長了還有腐敗的可能。因此從20世紀(jì)80年代起日本和美國先后開始研究用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)殼聚糖，國內(nèi)從20世紀(jì)90年代初也開始了這方面的研究，目前研究重點(diǎn)主要集中在菌株的選育和培養(yǎng)基的優(yōu)化［8-9］。此外，能脫除甲殼質(zhì)分子中的乙?；蓺ぞ厶堑募讱べ|(zhì)脫乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）在毛霉、根霉、曲霉和青霉等多種微生物中得以純化，為酶法生產(chǎn)殼聚糖奠定了基礎(chǔ)［7，10］，利用絲狀真菌制備殼聚糖必將成為一條大規(guī)模生產(chǎn)殼聚糖的有效途徑。本文通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)對黑曲霉產(chǎn)殼聚糖的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為微生物發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黑曲霉 天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院生物系保藏；酵母粉（OXOID）、蛋白胨（OXOID）、牛肉膏、瓊脂粉 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為分析純；基礎(chǔ)培養(yǎng)基及發(fā)酵條件 在含有4%葡萄糖，1%MgSO4，3%酵母粉和4%蛋白胨，自然pH的培養(yǎng)基上接種1mL 108個(gè)/mL黑曲霉菌懸液，裝液30mL于100mL發(fā)酵瓶中，放置在28℃，128r/min的恒溫?fù)u床上進(jìn)行發(fā)酵，3d后檢測殼聚糖含量。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 采用PDA培養(yǎng)基。

1.2.2 黑曲霉孢子數(shù)測定 系列稀釋及血球計(jì)數(shù)法［11］。

1.2.3 殼聚糖的提取 參考葉龍祥的方法［12］并加以改進(jìn)。取發(fā)酵液100mL在10000r/min的離心機(jī)上離心10min得菌體沉淀，加入重蒸水洗滌菌體沉淀至無色，稱菌體的濕重與干重，然后在所得沉淀中加入7%NaOH（菌體濕重∶堿=1∶10，g/mL），50℃下處理3h后離心，重蒸水洗滌沉淀至上清液無色；取上述沉淀，加入乙醇∶水=1∶1的20%NaOH溶液（菌體濕重∶堿 =1∶10，g/mL），與560W的微波爐處理10min，然后離心洗滌沉淀至上清液呈中性；接著取上述沉淀，加入5%乙酸（菌體濕重∶酸 =1∶15，g/mL），置于100℃的水浴鍋處理5h，離心分離，取上清液調(diào)節(jié)pH為8～10，直到出現(xiàn)大量白色沉淀為止，離心，用重蒸水洗滌沉淀至上清液呈中性，在50℃的真空干燥箱中干燥20min，得到白色固體，即為殼聚糖。1.2.4 殼聚糖產(chǎn)率計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間對殼聚糖產(chǎn)率的影響

接種黑曲霉，濃度為108個(gè)/mL，接入1mL，置于28℃，128r/min的恒溫?fù)u床上進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間分別為24、48、72、96h，每隔24h提取殼聚糖，進(jìn)行比較分析，每一時(shí)間平行做3組，結(jié)果如表1所示。

表1 發(fā)酵時(shí)間對殼聚糖產(chǎn)率的影響

由表1可知，發(fā)酵72h與24、48h之間有顯著差異，而與96h之間沒有顯著性差異。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，殼聚糖產(chǎn)率先升高后降低，在72h殼聚糖產(chǎn)率最高，所以最佳發(fā)酵時(shí)間為72h。

2.2 溫度對殼聚糖產(chǎn)率的影響

將發(fā)酵溫度分別控制在23、25、27、29、31、33℃，轉(zhuǎn)速為130r/min培養(yǎng)72h，提取殼聚糖，進(jìn)行比較分析，結(jié)果如表2所示。

表2 溫度對殼聚糖產(chǎn)率的影響

由表2可知，發(fā)酵溫度29℃與23、25、27、33℃之間有顯著性差異，29℃與31℃之間沒有顯著差異。隨著發(fā)酵溫度的升高，殼聚糖產(chǎn)率先升高后降低，在29℃時(shí)殼聚糖產(chǎn)率最高，最佳發(fā)酵溫度為29℃。

2.3 轉(zhuǎn)速對殼聚糖產(chǎn)率的影響

將發(fā)酵溫度控制在29℃，搖床轉(zhuǎn)速分別取120、125、130、135、140、145r/min，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)72h，提取殼聚糖，進(jìn)行比較分析，結(jié)果如表3所示。

表3 搖床轉(zhuǎn)速對殼聚糖產(chǎn)率的影響

由表3可知，發(fā)酵時(shí)搖床轉(zhuǎn)速130r/min與135、140、145r/min無顯著差異，而與120、125r/min有顯著差異，隨著轉(zhuǎn)速的增大，殼聚糖產(chǎn)率先升高后降低，在130r/min時(shí)殼聚糖產(chǎn)率最高，所以最佳搖床轉(zhuǎn)速為130r/min。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，其中四因素分別為培養(yǎng)基中葡萄糖、玉米漿和硫酸鎂的含量及黑曲霉接種量，結(jié)果如表4所示。

表4 基礎(chǔ)培養(yǎng)液正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析

由表4極差分析可知，各因素影響殼聚糖產(chǎn)率的順序依次是：硫酸鎂＞玉米漿＞葡萄糖＞孢子量。可以確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：70mL/L玉米漿，4%葡萄糖，1.2%硫酸鎂，8.0×108孢子量，在此培養(yǎng)條件下得到最高產(chǎn)率為18%。

3 結(jié)論

利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖，其產(chǎn)率受發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、時(shí)間、接種量和培養(yǎng)基成分及其pH等因素的影響。在考察單因素影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度控制在29℃以下，殼聚糖產(chǎn)率隨溫度的升高而增加；這是由于在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度的升高對菌株的生長和增殖具有一定的促進(jìn)作用。搖床轉(zhuǎn)速為130r/min時(shí)，殼聚糖產(chǎn)率達(dá)到最大，繼續(xù)增大轉(zhuǎn)速，其產(chǎn)率呈下降趨勢；這是由于轉(zhuǎn)速過大破壞了菌絲體，影響后期菌體的收集。最佳發(fā)酵時(shí)間為72h，延長發(fā)酵時(shí)間，殼聚糖產(chǎn)率亦呈下降趨勢；這是由于培養(yǎng)初期菌絲體迅速生長，殼聚糖量也迅速積累，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，殼聚糖量逐漸達(dá)到飽和，而菌絲體的量也不再增加，而且有一些菌絲面臨溶菌；另一方面，殼聚糖的相對分子質(zhì)量隨著培養(yǎng)期的延長也會迅速下降。

通過上述一系列實(shí)驗(yàn)得出黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖的最佳發(fā)酵工藝為：70mL/L玉米漿，4%葡萄糖，1.2%硫酸鎂，8.0×108孢子量，pH7.4～7.6，轉(zhuǎn)速為130r/min，29℃發(fā)酵72h的殼聚糖的產(chǎn)率最高。

［1］周文清，江堃.殼聚糖的研究進(jìn)展［J］.景德鎮(zhèn)高專學(xué)報(bào)，2008，23（2）：46-48.

［2］李潤銘，鄧順周.甲殼素及殼聚糖在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.食品與藥品，2007，9（12）：50-53.

［3］孫冀平.殼聚糖及其應(yīng)用［J］.中國食品添加劑，2005（5）：83-86.

［4］翟榮玲，劉艷琴，孫豐林，等.殼聚糖應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.山東畜牧獸醫(yī)，2008，29（9）：36-38.

［5］楊艾玲.殼聚糖的研究進(jìn)展［J］.化工中間體，2009（10）：17-20.

［6］SHAHIDI F，ARACHCHI J K V，JEON Y-J.Food applications of chitin and chitosans［J］.Trends in Food Science& Technology，1999（10）：37-51.

［7］趙祥穎，劉麗萍，劉建軍.微生物甲殼質(zhì)脫乙酰酶的研究進(jìn)展［J］.食品與藥品，2008，10（7）：38-41.

［8］譚天偉，王炳武，陳鵬.生物法生產(chǎn)殼聚糖［J］.化工進(jìn)展，2001（9）：4-5.

［9］NADARAJAH K，KADER J，MOHD MAZMIRA，et al. Production of Chitosan by Fungi［J］.Pakistan Journal of Biological Sciences，2001，4（3）：263-265.

［10］BANKS I R，SPECHT C A，DONLIN M J，et al.A Chitin Synthase and Its Regulator Protein Are Critical for Chitosan Production and Growth of the Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans［J］.EUKARYOTIC CELL，2005，4（11）：1902-1912.

［11］周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］.北京：高等教育出版社，2006.

［12］葉龍祥，劉清斌.黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖工藝研究［J］.化學(xué)與生物工程，2007，24（7）：45-48.

Optimization of technology of chitosan fermentation by Aspergillus niger

LI Yi-jing，WANG Ting-pu，MA Wei-chao，ZHANG Wen-ke
（College of Life Science&Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，China）

The optimum condition for chitosan fermentation by Aspergillus niger were studied by single factor and orthogonal experiments.The optimal conditions of chitosan production were as follows：70mL/L corn steep liquor，4g/L glucose，1.2g/L of magnesium sulfate，8.0×108spores，pH 7.4～7.6，130r/min，29℃ for 72h.There was a maximum productivity of chitosan 18%.

Aspergillus niger；chitosan；optimization

TS201.3

A

1002-0306（2010）12-0162-03

2010-05-14

李一婧（1981-），女，講師，主要從事天然產(chǎn)物生理生化分析研究。

天水師范學(xué)院研究基金資助（TSA0920）。