張小軍，張 虹

（1.浙江工商大學(xué)，浙江杭州310035；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山316100）

鮟鱇魚硫酸軟骨素的提取及性質(zhì)研究

張小軍1，2，張 虹1，*

（1.浙江工商大學(xué)，浙江杭州310035；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山316100）

建立了從鮟鱇魚骨中提取硫酸軟骨素的方法，并對提取工藝進行了優(yōu)化。樣品用20%氯化鈉堿溶液浸提，pH7.8條件除去中性蛋白，pH2.5除去酸性蛋白，然后用70%（v/v）乙醇沉淀獲得鮟鱇魚硫酸軟骨素。本方法硫酸軟骨素的得率為3.47%，所得鮟鱇魚硫酸軟骨素產(chǎn)品為白色粉末，純度為90.94%。對鮟鱇魚硫酸軟骨素的理化性質(zhì)研究表明，其水分含量為8.88%，氮含量為2.86%，氨基己糖含量為30.12%，葡萄糖醛酸含量為31.40%。從鮟鱇魚骨中提取出的硫酸軟骨素產(chǎn)品電泳實驗顯示為單點，表明其為單一糖胺聚糖，紅外光譜吸收特征顯示其為硫酸軟骨素C。

鮟鱇魚，硫酸軟骨素，提取，分析

硫酸軟骨素（Chondroitin sulfate，CS）是一類糖胺聚糖（GAGs），它是由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖以1，3糖苷鍵結(jié)合的雙糖為基本單位聚合而成的大分子多糖，根據(jù)硫酸基團在N-乙酰-D-氨基半乳糖上的位置不同可分為硫酸軟骨素A（CS-A）、硫酸軟骨素C（CS-C）等。CS資源豐富，廣泛存在于人和動物的骨骼、軟骨、肌腱、韌帶等組織中。CS作為一種藥物，主要用來治療關(guān)節(jié)炎和冠心?。?-2］，對神經(jīng)痛、偏頭痛、動脈粥樣硬化等［3］也有一定療效。硫酸軟骨素傳統(tǒng)上主要從豬、牛、羊等畜類軟骨組織中提取獲得，來源和工藝［4］較為單一。近年來，海洋生物作為新的藥用資源日漸受到重視，有研究從孔鰩［5］、魷魚［6］中提取硫酸軟骨素，但對于其他海洋魚類硫酸軟骨素的研究鮮有報道。鮟鱇魚（Lophius litulon）在我國資源主要分布在黃海、渤海及東海北部，由于日本、美國等國家居民喜食鮟鱇魚，近年來出口需求旺盛，產(chǎn)量和價格均有大幅增加。鮟鱇魚經(jīng)產(chǎn)業(yè)化加工后魚肉、魚肝等用于出口，同時產(chǎn)生大量的下腳料-魚骨，有待進一步開發(fā)利用。實際生產(chǎn)中魚骨如不加處理，會造成環(huán)境污染，同時也是對寶貴資源的浪費。針對這一問題，本文以簡便、成本低廉的方法從鮟鱇魚骨中提取硫酸軟骨素，并研究了鮟鱇魚硫酸軟骨素的理化性質(zhì)，以提高其經(jīng)濟價值，為有效利用鮟鱇魚加工下腳料資源提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮟鱇魚骨 舟山水產(chǎn)公司提供；硫酸軟骨素A美國Sigma公司；鹽酸氨基葡萄糖、D-葡萄糖醛酸國藥集團化學(xué)試劑有限公司；對二甲氨基苯甲醛、巴比妥 上?；瘜W(xué)試劑廠；乙酰丙酮、硫酸 優(yōu)級純；咔唑、甲苯胺藍、冰乙酸、鹽酸、十六烷基三甲基溴化銨、甲酚紅、瓊脂糖、氫氧化鈉、氯化鈉、無水乙醇均為分析純，購自華東醫(yī)藥公司。

723分光光度計 上海第三分析儀器廠；pH計杭州華光無線電廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州科工貿(mào)有限公司；恒溫水浴箱 上海醫(yī)療器械五廠；水平電泳槽 北京市六一儀器廠；AVATAR-360型紅外光譜儀 美國尼高力公司；攪拌機 杭州儀表電機廠；離心沉淀機 上海醫(yī)用分析儀器廠；冷凍干燥儀 北京博醫(yī)康實驗儀器公司。

1.2 實驗方法

表2 不同pH條件下鹽解除蛋白方法的比較（n=6）

1.2.1 原料處理 新鮮鮟鱇魚骨將余肉剔凈，濕骨60℃烘干后粉碎成粉末，4℃干燥保存。

1.2.2 提取工藝 浸提：取100g干骨粉加20%的NaCl溶液500mL，攪拌使其溶解，然后用10%的NaOH溶液調(diào)pH至12.5，40℃恒溫攪拌提取10h，提取過程中隨時校正pH至12.5。提取液過濾，濾渣在相同條件下重復(fù)提取一次，合并兩次濾液。

鹽解除蛋白：濾液用10%的HCl溶液調(diào)pH至7.8，90℃恒溫鹽解20min，迅速降溫至室溫，靜置2h，得鹽解液。鹽解液3000r/min離心10min，過濾除去中性蛋白沉淀。濾液繼續(xù)調(diào)鹽解液pH至2.5，攪拌10min，3000r/min離心10min，過濾除去酸性蛋白沉淀，然后濾液調(diào)pH至6.5，得清亮的鹽解液。

乙醇沉淀：在所得鹽解液中不斷攪拌加乙醇至溶液體系中乙醇體積分數(shù)為70%，靜置12h以上，收集沉淀用無水乙醇洗滌兩次，真空冷凍干燥得鮟鱇魚硫酸軟骨素產(chǎn)品。

1.3 分析方法

1.3.1 氨基己糖含量測定 采用衛(wèi)生部頒布藥品標準規(guī)定的方法［7］，并根據(jù)謝繼青等人［8］對關(guān)鍵的兩步：乙?；惋@色操作分別進行了改進，做到冰浴乙?；瑫r計時，顯色隨加隨計時。氨基己糖含量× 2.82即為CS的含量。

1.3.2 葡萄糖醛酸含量測定 按照文獻方法［9］進行測定。

1.3.3 氮含量測定 按照微量凱氏定氮法［10］進行測定。

1.3.4 水分含量測定 按照常壓干燥法［11］進行測定。

1.3.5 瓊脂糖電泳法分析 按照文獻方法［12］進行測定。

1.3.6 紅外光譜分析 在400～4000cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描，KBr壓片測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝

2.1.1 不同鹽離子強度對CS提取率的影響 取四份100g干頭骨粉分別以15%、20%、25%的NaCl溶液對其進行浸提，其它提取步驟均按基本提取工藝，結(jié)果如表1所示。溶液中鹽濃度對提取有很大的影響，鹽濃度較低時，離子強度低，造成提取不完全，同時得到的產(chǎn)品含有較多蛋白質(zhì)，造成溶解性偏低；當鹽濃度過高時，高濃度鹽在后續(xù)工藝中造成產(chǎn)品變色，同時提取率會降低。實驗表明，20%NaCl對CS的提取效果最好。

表1 不同濃度NaCl對CS得率和顏色的影響（n=6）

2.1.2 不同pH對除蛋白的影響 取四份經(jīng)基本工藝步驟2.1.1提取得到的浸提液，進行如下鹽解除蛋白操作：第一份在pH7.8條件下升溫鹽解，然后離心除蛋白；第二份在pH2.5條件下升溫鹽解，然后離心除蛋白；第三份先在pH2.5條件下升溫鹽解，然后離心除蛋白，接著再調(diào)pH至7.8，再離心除蛋白；第四份先在pH7.8條件下升溫鹽解，然后離心除蛋白，接著再調(diào)pH至2.5，再離心除蛋白。Bradford染料結(jié)合法［9］測定以上除蛋白后各鹽解溶液的吸光值。

對不同pH條件處理鹽解液除蛋白的結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，采用先在pH7.8條件下升溫鹽解，然后離心除去中性蛋白，接著再調(diào)pH至2.5，再離心除去酸性蛋白的方法除蛋白效果最好。此時溶液呈澄清透明，蛋白質(zhì)含量最低，證明使用該方法可獲得較好的除蛋白效果。

2.1.3 醇沉條件的選擇 取四份100g干骨粉按基本提取工藝提取CS，在乙醇沉淀時，分別加乙醇至體系中乙醇含量分別為60%、65%、70%、75%，其結(jié)果如表3所示。由表3可知，60%乙醇沉淀CS含量最高，但得率較低，并未將硫酸軟骨素完全沉淀；75%的乙醇使溶液總體積過大，不利于收集，造成了沉淀收集時的損失從而使得率偏低；70%乙醇得到的得率最高，在該濃度條件下溶液中糖胺聚糖的沉淀效果最好。因此選擇70%乙醇沉淀糖胺聚糖，此時得率為3.52%，氨基己糖含量為26.42%。

表3 不同乙醇濃度（v/v）對提取效果的影響（n=6）

2.2 理化性質(zhì)分析

取100g鮟鱇魚骨粉按照優(yōu)化的工藝提取CS，然后測定所得CS的各項指標，其結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，鮟鱇魚硫酸軟骨素各項指標均符合衛(wèi)生部頒布藥品標準規(guī)定的硫酸軟骨素指標［7］。

表4 鮟鱇魚硫酸軟骨素的理化性質(zhì)（n=6）

2.3 瓊脂糖凝膠電泳

分別對椎骨提取所得CS和頭骨提取所得CS進行電泳，結(jié)果如圖1所示。電泳結(jié)果顯示，椎骨和頭骨所得提取物均與CS標準品一致，且均為單一的藍紫色電泳點，證明所得產(chǎn)品純度較高，不含其他糖胺聚糖。

圖1 鮟鱇魚硫酸軟骨素的瓊脂糖電泳圖

2.4 紅外吸收光譜

鮟鱇魚硫酸軟骨素的紅外光譜圖如圖2所示，紅外光譜在3440cm-1附近有強吸收，說明有多糖羥基（-OH）；在1569、1635cm-1附近有強吸收，說明有乙酰氨基（-NHCOCH3-）存在；1423cm-1附近有吸收，說明有羧基（-COO-）存在。在1249cm-1附近有弱吸收，說明有硫酸基（-O-SO3-）存在。以上這些紅外光譜特征與CS-C的國外報道［13］一致，表明鮟鱇魚硫酸軟骨素為硫酸軟骨素C。

圖2 鮟鱇魚硫酸軟骨素紅外光譜圖

3 結(jié)論

通過系統(tǒng)的實驗建立了鮟鱇魚骨中提取硫酸軟骨素的方法，為有效利用鮟鱇魚加工下腳料資源提供了新途徑。樣品用20%氯化鈉堿溶液浸提，接著在pH7.8條件除去中性蛋白，再pH2.5除去酸性蛋白，然后用70%乙醇沉淀獲得鮟鱇魚硫酸軟骨素。本方法硫酸軟骨素得率為3.47%，所得鮟鱇魚硫酸軟骨素產(chǎn)品為白色粉末，水分含量為8.88%，氨基己糖含量為30.12%，葡萄糖醛酸含量為31.40%。從鮟鱇魚骨中提取出的硫酸軟骨素產(chǎn)品電泳實驗顯示為單點，表明其為單一糖胺聚糖。紅外光譜吸收特征顯示其為硫酸軟骨素C。

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Preparation and properties of chondroitin sulfate from Lophius litulon bones

ZHANG Xiao-jun1，2，ZHANG Hong1，*
（1.Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China；2.Zhejiang Marine Fisheries Research Institute，Zhoushan 316100，China）

A method of preparation of chondroitin sulfate from Lophius litulon bones was studied.Briefly，sample were extracted with 20%NaCl，and the solution was removed neutral protein at 90℃，pH7.8，then centrifuging to remove the acidic protein again at pH2.5，finally using 70%（v/v）enthanol to deposit the CS.The yield of this method was 3.47%，and the chondroitin sulfate product was white power，the purity was 90.94%.The CS physicochemical analysis showed that the contents of moisture，nitrogen，hexosamine and uronic acid were 8.88%，2.86%，30.12%，31.40%，respectively.The results of agarose gel electrophoresis reflected that the chondroitin sulfate from Lophius litulon was purified.The lR spectrum showed that chondroitin sulfate from Lophius litulon was CS-C.

Lophius litulon；chondroitin sulfate；extraction；analysis

TS254.1

B

1002-0306（2010）12-0258-03

2009-11-11 *通訊聯(lián)系人

張小軍（1982-），男，工程師，在讀博士，研究方向：水產(chǎn)品加工及水產(chǎn)品質(zhì)量安全。