孫兆遠(yuǎn)，侯會(huì)絨

（江蘇食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003）

萌發(fā)糙米中不溶性多酚提取工藝的研究

孫兆遠(yuǎn)，侯會(huì)絨

（江蘇食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003）

以萌發(fā)糙米為原料提取不溶性多酚類化合物，探討堿水解條件和乙酸乙酯萃取條件對(duì)不溶性多酚提取得率的影響。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，確定堿水解最佳條件為：粉碎粒度40目、NaOH濃度1.5mol/L、水解時(shí)間2.5h、料液比1∶18；乙酸乙酯萃取最佳條件為：乙酸乙酯添加量40mL、萃取時(shí)間30min、振蕩速度200r/min、pH2.0。在此條件下不溶性多酚提取得率為32.35mg/100g。

萌發(fā)糙米，不溶性多酚，提取

多酚類物質(zhì)是廣泛存在于自然界中的一類酚羥基結(jié)構(gòu)的化合物［1］，具有很強(qiáng)的抗氧化性和抗自由基能力［2］，能阻礙氧化物破壞脂類和低密度脂蛋白［3］、抑制血小板凝聚［4］、降低冠心病和癌癥的幾率［5］，還具有延緩組織和人體衰老等功效，是很好的抗氧化物質(zhì)［6］。現(xiàn)代流行病學(xué)研究表明，食用全粒谷物或相關(guān)產(chǎn)品對(duì)降低心腦血管等慢性疾病具有很好的效果，主要是因?yàn)槿９任镏械亩喾宇愇镔|(zhì)的作用。植物多酚是植物體內(nèi)次生代謝的中間產(chǎn)物，以游離態(tài)、酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)的形式存在于植物體中，游離態(tài)和酯化態(tài)被稱為可溶性酚類［7］，主要有阿魏酸、對(duì)香豆酸［8］、原兒茶酸、沒(méi)食子酸、咖啡酸［9］、芥子酸［10］等；結(jié)合態(tài)被稱為不溶性酚類，以酯鍵、糖苷鍵、醚苷鍵等形式與其他物質(zhì)（包括蛋白質(zhì)、單糖、有機(jī)酸等）相結(jié)合［7］。谷物中的多酚絕大多數(shù)以結(jié)合形式存在（玉米85%、燕麥75%、小麥75%）［11］。目前，相關(guān)的論文報(bào)道中對(duì)谷物中酚類物質(zhì)均采用甲醇、乙醇、丙酮的水溶液進(jìn)行提取，為了提高提取得率，多采用延長(zhǎng)提取時(shí)間或者是對(duì)谷物進(jìn)行粉碎處理。報(bào)道中沒(méi)有對(duì)不溶性多酚進(jìn)行水解，因此提取得率很低。谷物在萌發(fā)過(guò)程中，淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶被激活，其質(zhì)構(gòu)有所改善且營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變得容易消化和吸收［12］，同時(shí)苯丙烷代謝增強(qiáng)，使得多酚類物質(zhì)含量增多，抗氧化能力增強(qiáng)［5］。本研究以萌發(fā)糙米為原料提取不溶性多酚，以提取得率為指標(biāo)，探討了堿水解條件和乙酸乙酯萃取條件對(duì)提取得率的影響，以得出不溶性多酚最佳提取方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘇北大米 由淮安市清浦區(qū)蘇鑫米廠提供；萌發(fā)糙米 自制；阿魏酸、Folin-Ciocalteu試劑 Sigma公司；其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HP250GS-C型智能人工氣候箱 武漢瑞華；WF180萬(wàn)能粉碎機(jī) 上海光學(xué)儀器廠；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮；BS-1E振蕩培養(yǎng)箱 蘇州威爾；TU-1900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析；VF203真空抽濾裝置 北京桑翌；JA1003A電子精密天平 上海倫捷；PHS-3C酸度計(jì) 上海雷磁。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 糙米萌發(fā)條件：準(zhǔn)確稱量糙米400g，用水洗凈，加水2000mL，于32℃條件下浸泡21h，選取芽長(zhǎng)1mm的萌發(fā)糙米作為試樣，低溫凍干后，用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，然后于-20℃條件下冷凍儲(chǔ)存。

1.2.2 不溶性多酚的提取 精確稱取5.0g磨碎的萌發(fā)糙米樣品，己烷（4×50mL，30min每次）脫脂，抽濾后放于烘箱中烘干，然后用70%乙醇去除游離酚酸。殘?jiān)隢aOH溶液中在充氮條件下水解。離心分離后，混合上清液，用HCl調(diào)至酸性，加入乙酸乙酯于恒溫振蕩箱中振蕩萃取3次［11］?；旌陷腿∫河?5℃充氮旋轉(zhuǎn)蒸干后用甲醇定容至50mL。

1.2.3 不溶性多酚含量的測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mL 1.0mg/mL阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于50mL容量瓶中，加入2mL 20%Folin-Ciocalteu試劑，混勻后靜置5min，再加入5mL 7.5%Na2CO3溶液混勻，用去離子水定容至50mL，35℃下避光靜置30min，以去離子水做空白，在768nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，阿魏酸在0～60μg/mL范圍內(nèi)線性回歸方程為y=0.00809x+0.00071，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9989，結(jié)果符合朗伯比爾定律，表面線性關(guān)系良好，可用于萌發(fā)糙米提取液多酚含量測(cè)定。

式中：c-提取液中多酚濃度；v-提取液體積；m-樣品質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿水解條件的確定

2.1.1 粉碎粒度對(duì)不溶性多酚提取得率的影響 精確稱取目數(shù)分別為10、20、30、40、50、60目的6份樣品各5.0g，按照操作步驟1.2.2進(jìn)行不溶性多酚水解和提取，提取物按照1.2.3進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，多酚提取得率隨粉碎粒度的增大而迅速增加，主要因?yàn)椴诿最w粒越小，比表面積越大，在單位時(shí)間內(nèi)與堿液接觸面積越大，分解速度增加，提取得率也就越大。但當(dāng)糙米粒度小于30目時(shí)，提取得率開(kāi)始下降，原因可能是糙米顆粒內(nèi)部的淀粉等其它物質(zhì)浸出速度加快，提取液黏度增大，將不溶性多酚包裹，阻礙了堿液與不溶性多酚的接觸，使得分解速度減弱，水解液過(guò)濾困難，對(duì)乙酸乙酯萃取造成較大影響。由此可見(jiàn)，粉碎粒度以30目為宜。

2.1.2 NaOH濃度對(duì)不溶性多酚提取得率的影響分別量取濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mol/L NaOH溶液各100mL，按照操作步驟1.2.2進(jìn)行不溶性多酚水解和提取，提取物按照1.2.3進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 粉碎粒度對(duì)多酚提取得率的影響

圖3 NaOH濃度對(duì)多酚提取得率的影響

由圖3可知，隨著NaOH濃度的增大，不溶性多酚與蛋白質(zhì)、單糖、有機(jī)酸等結(jié)合形成的酯鍵、糖苷鍵、醚苷鍵被破壞，酚酸由結(jié)合形式轉(zhuǎn)為游離形式游離到堿液之中，使得提取得率增大。當(dāng)NaOH濃度增加到1.5mol/L時(shí)，提取得率達(dá)到最大值，之后緩慢降低，這主要是因?yàn)樵谒嵝詶l件下酚類物質(zhì)比較穩(wěn)定，而在強(qiáng)堿性條件下，其分子容易發(fā)生斷裂而分解［13］。同時(shí)，在強(qiáng)堿條件下淀粉、纖維素發(fā)生水解，使得溶液黏度增加，一定程度上抑制了多酚物質(zhì)的浸出。因此，NaOH濃度為1.5mol/L較好。

2.1.3 堿水解時(shí)間對(duì)不溶性多酚提取得率的影響

精確稱取樣品8份各5.0g，按照操作步驟1.2.2分別水解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h后進(jìn)行提取，提取物按照1.2.3進(jìn)行含量測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 水解時(shí)間對(duì)多酚提取得率的影響

由圖4可知，多酚提取得率隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，主要是因?yàn)樗夥磻?yīng)開(kāi)始時(shí)反應(yīng)底物濃度較大，NaOH與不溶性多酚與其他物質(zhì)結(jié)合的酯鍵、糖苷鍵、醚苷鍵接觸的機(jī)會(huì)大，使得反應(yīng)迅速進(jìn)行。當(dāng)水解時(shí)間到達(dá)2.0h時(shí)，多酚提取得率出現(xiàn)峰值，之后隨時(shí)間延長(zhǎng)而緩慢降低。這主要是因?yàn)閺?qiáng)堿性條件下，多酚物質(zhì)發(fā)生分解反應(yīng)造成。因此選擇水解時(shí)間為2.0h較好。

2.1.4 料液比對(duì)不溶性多酚提取得率的影響 分別量取50、60、70、80、90、100、110、120mL的NaOH溶液，按照操作步驟1.2.2進(jìn)行不溶性多酚水解和提取，提取物按照1.2.3進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 料液比對(duì)多酚提取得率的影響

由圖5可知，當(dāng)料液比為1∶10時(shí)，不溶性多酚提取得率很低（3.50mg/100g），這主要是提取液呈黏稠狀態(tài)，不利于NaOH水解和乙酸乙酯的萃取。當(dāng)料液比逐漸增大時(shí)，堿水解速度增加，提取得率也增加，并在料液比為1∶18時(shí)出現(xiàn)峰值。之后隨料液比的增大，提取得率緩慢降低，這可能是因?yàn)榱弦罕仍龃笫沟锰崛∫褐卸喾訚舛冉档?，與乙酸乙酯中多酚濃度的差值降低，萃取不徹底，另外，堿水解液添加量增大，溶液pH上升，多酚穩(wěn)定性變差。因此選擇料液比1∶18為好，即NaOH的添加量為90mL。

2.1.5 堿水解最佳條件的確定 在單因素的基礎(chǔ)上，以粉碎粒度、NaOH濃度、水解時(shí)間及料液比為考察因素，以不溶性多酚提取得率為指標(biāo)，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)確定堿水解最佳條件。因素水平見(jiàn)表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 堿水解因素水平表

由表2中R值可以看出，各因素對(duì)結(jié)果的影響次序?yàn)椋篊＞B＞D＞A，即水解時(shí)間對(duì)提取得率的影響最大，NaOH濃度次之，粉碎粒度對(duì)提取得率的影響最小。

表2 堿水解正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2中提取得率水平對(duì)應(yīng)的k值可以看出，本實(shí)驗(yàn)的最佳組合A3B2C3D2，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)該條件下不溶性多酚提取得率高于正交實(shí)驗(yàn)中的最大值，因此確定最佳堿水解條件為：粉碎粒度40目、NaOH濃度1.5mol/L、水解時(shí)間2.5h、料液比1∶18。

2.2 乙酸乙酯萃取條件的確定

2.2.1 乙酸乙酯添加量對(duì)不溶性多酚提取得率的影響 分別量取10、20、30、40、50、60、70、80mL乙酸乙酯，按照操作步驟1.2.2進(jìn)行不溶性多酚水解和提取，提取物按照1.2.3進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 乙酸乙酯添加量對(duì)多酚提取得率的影響

由圖6可知，當(dāng)乙酸乙酯添加量為10mL時(shí)，不溶性多酚提取得率處于較低水平（9.90mg/100g），這主要是因?yàn)樗庖航?jīng) HCl調(diào)節(jié) pH后體積可達(dá)250mL，10mL的乙酸乙酯不足以將所有多酚萃取出來(lái)，同時(shí)，乙酸乙酯微溶于水，致使體積降低。隨著乙酸乙酯添加量的增大，提取得率逐漸增大，當(dāng)添加量為40mL時(shí)接近最大值，再增加乙酸乙酯的量，提取得率略有上升，但給蒸發(fā)濃縮帶來(lái)困難，當(dāng)添加量大于60mL后，提取得率出現(xiàn)下降，這就是旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過(guò)程中多酚氧化損失造成的。因此選擇乙酸乙酯添加量40mL為好。

2.2.2 萃取時(shí)間對(duì)不溶性多酚提取得率的影響 精確稱取樣品8份各5.0g，按照操作步驟1.2.2分別萃取5、10、15、20、25、30、35、40min，提取物按照1.2.3進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 振蕩時(shí)間對(duì)多酚提取得率的影響

由圖7可知，多酚提取得率隨振蕩時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，其中前25min內(nèi)增加速度較快，當(dāng)振蕩時(shí)間大于25min后，提取得率基本變化不大，為提高生產(chǎn)效率，減少多酚氧化，選擇振蕩時(shí)間為25min較好。

2.2.3 振蕩速度對(duì)不溶性多酚提取得率的影響 精確稱取5份樣品各5.0g，按照操作步驟1.2.2在轉(zhuǎn)速分別為50、100、150、200、250r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩萃取，提取物按照1.2.3進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8可知，多酚提取得率隨振蕩速度的增加逐漸增大，當(dāng)速度在200r/min時(shí)多酚提取得率接近最大值，隨后緩慢增大，但當(dāng)速度達(dá)到250r/min，由于振蕩速度過(guò)大，三角瓶中溶液有濺出，因此選擇振蕩速度為200r/min較好。

2.2.4 pH對(duì)不溶性多酚提取得率的影響 精確稱取5份樣品各5.0g，按照操作步驟1.2.2用HCl分別調(diào)至pH為1、2、3、4、5、6，然后加入乙酸乙酯萃取，提取物按照1.2.3進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖8 振蕩速度對(duì)多酚提取得率的影響

圖9 pH對(duì)多酚提取得率的影響

由圖9可知，多酚提取得率先隨pH的增加而降低，這主要是因?yàn)槎喾宇愇镔|(zhì)在酸性條件下較穩(wěn)定，而在堿性條件下，其分子容易發(fā)生斷裂而分解。另外由于振蕩時(shí)無(wú)法進(jìn)行充氮處理，振蕩過(guò)程中會(huì)帶入氧氣，使得多酚物質(zhì)發(fā)生分解或生成其他物質(zhì)，因此選擇pH為2.0。

2.2.5 乙酸乙酯萃取最佳條件的確定 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙酸乙酯添加量、萃取時(shí)間、振蕩速度及pH為考察因素，以不溶性多酚提取得率為指標(biāo)，采用L9（34）實(shí)驗(yàn)確定最佳萃取條件。因素水平見(jiàn)表

3，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 乙酸乙酯萃取因素水平表

由表4中R值可知，各因素對(duì)結(jié)果的影響次序?yàn)椋篊＞D＞B＞A，即振蕩速度對(duì)不溶性多酚提取得率的影響最大，pH次之，乙酸乙酯添加量對(duì)提取得率的影響最小。由表4中乙酸乙酯萃取實(shí)驗(yàn)水平對(duì)應(yīng)的k值可知，本實(shí)驗(yàn)的最佳組合A2B3C2D2，即不溶性多酚提取得率最高時(shí)，最佳萃取條件為：乙酸乙酯添加量40mL、萃取時(shí)間30min、振蕩速度200r/min、pH2.0。

表4 乙酸乙酯萃取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

因?yàn)锳2B3C2D2的提取條件不在正交實(shí)驗(yàn)表中，所以按此提取條件補(bǔ)做3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，在設(shè)定的提取條件下，不溶性多酚的提取得率較高（32.35mg/100g）且穩(wěn)定，平均得率超過(guò)正交實(shí)驗(yàn)最大值，具有可行性和實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交文驗(yàn)，確定萌發(fā)糙米中不溶性多酚物質(zhì)的堿水解最佳參數(shù)為：粉碎粒度40目、NaOH濃度1.5mol/L、水解時(shí)間2.5h、料液比1∶18；乙酸乙酯萃取最佳條件為：乙酸乙酯添加量為40mL、萃取時(shí)間為30min、振蕩速度200r/min、pH2.0。在此條件下不溶性多酚提取得率為32.35mg/100g。

［1］Shashidi F，Wanasundara PK.Phenolic antioxidants［J］.Crit Rev Food Sci Nutr，1992，32：67-103.

［2］Morton LW，Abu-Amsha Caccetta R，Puddey IB，et al. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds：relevance to cardiovascular disease［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2000，27：152-159.

［3］Daniel O，Meier MS，Schlatter J，et al.Selected phenolic compoundsin cultivated plants：Ecologic functions，health implications，and modulation by pesticides［J］.Environ Health Perspect，1999，107：109-114.

［4］Newmark HL.Plant phenolics as potential cancer prevention agents［J］.Adv Exp Med Biol，1996，401：25-34.

［5］Tian S，Nakamura K，Kayahara H.Analysis of Phenolic Compounds in White Rice，Brown Rice，and Germinated Brown Rice［J］.J Agric Food Chem，2004，52：4808-4813.

［6］Scalbert A，Williamson G.Dietary intake and bioavailability of polyphenols［J］.J Nutr，2000，130：2073S-85S.

［7］Jung MY，Jeon BS，Bock JY.Free，esterified，and insolublebound phenolic acids in white and red Korean ginsengs［J］.Food Chemistry，2002，79（1）：105-111.

［8］Ayumi H，Masatsune M，Seiichi H.Analysis of free and bound phenolics in rice［J］.Food Science and Technology Research，1999（5）：74-79.

［9］Rao MS，Muralikrishna G.Evaluation of the antioxidant properties of free and bound phenolic acids from native and malted finger millet［J］.J Agric Food Chem，2001，50（4）：889-892.

［10］Bunzel M，Allerdings E，Sinwell V，et al.Cell wall hydroxycinnamates in wild rice（Zizania aquatica L.）insoluble dietary fibre［J］.European Food Research and Technology，2002，214（6）：482-488.

［11］Adom KK，Liu RH.Antioxidant activity of grains［J］.J Agric Food Chem，2002，50（21）：6182-6187.

［12］Oste RE.Digestibility of processed food protein［J］.Adv Exp Med Biol，1991，289：371-388.

［13］馮艷麗，員月明，夏艷.堿法水解大豆異黃酮工藝條件研究［J］.中國(guó)油脂，2009，34（5）：56-58.

Extraction technology of bound phenolics in pre-germinated brown rice

SUN Zhao-yuan，HOU Hui-rong
（Jiangsu Food Science College，Huai’an 223003，China）

The factors of alkaline hydrolysis and ethyl acetate extraction，which influence the extraction yield in the technology for extraction of bound phenolics from pre-germinated brown rice，were researched through single factor experiments and orthogonal experiment.The optimum technological parameters for extraction of bound phenolics were determined：particle size 40 mesh，NaOH concentration 1.5mol/L，alkaline hydrolysis 2.5h，solidliquid ratio 1∶18.The extraction parameters were addition of ethyl acetate 40mL，extraction time 30min，shake speed 200r/min，pH2.0.The yield of bound phenolics could reach 32.35mg/100g.

pre-germinated brown rice；bound phenolics；extraction technology

TS210.1

B

1002-0306（2010）12-0231-05

2010-07-07

孫兆遠(yuǎn)（1979-），男，講師，主要從事天然產(chǎn)物活性成分的提取與應(yīng)用研究。

淮安市2008年度科技支撐計(jì)劃（工業(yè)）項(xiàng)目（HAG08056）。