莊志凱，陳康玉，彭 珩，曹文紅，高加龍，盧虹玉，池岸英，藍(lán)尉冰，吉宏武

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524025；2.廣東省高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524088）

南美白對(duì)蝦蝦頭蛋白酶提取工藝的研究

莊志凱1，陳康玉1，彭 珩1，曹文紅1，高加龍1，盧虹玉1，池岸英1，藍(lán)尉冰1，吉宏武2，*

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524025；2.廣東省高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524088）

以南美白對(duì)蝦蝦頭為原料，對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究pH、溫度和料液比對(duì)內(nèi)源蛋白酶活力的影響，然后設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)確定內(nèi)源蛋白酶的最佳提取條件，初步研究?jī)?nèi)源蛋白酶硫酸銨分級(jí)沉淀的最佳飽和度。結(jié)果表明：內(nèi)源蛋白酶在pH為2和8時(shí)酶活力較高。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出酸性蛋白酶最佳提取條件為緩沖溶液pH3，料液比1∶2，溫度30℃；堿性蛋白酶最佳提取條件為緩沖溶液pH8，料液比1∶3，溫度50℃。酸性蛋白酶進(jìn)行初步分離的結(jié)果是硫酸銨一級(jí)沉淀飽和度10%，硫酸銨二級(jí)沉淀飽和度50%；堿性蛋白酶進(jìn)行初步分離的結(jié)果是硫酸銨一級(jí)沉淀飽和度20%，硫酸銨二級(jí)沉淀飽和度80%。

南美白對(duì)蝦，內(nèi)源蛋白酶，提取工藝，參數(shù)優(yōu)化，硫酸銨分級(jí)沉淀

對(duì)蝦是人類蛋白質(zhì)的重要來(lái)源，是我國(guó)大宗水產(chǎn)品之一。近年來(lái)，我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖迅猛發(fā)展，每年的產(chǎn)量都保持在100萬(wàn)t以上，其中南美白對(duì)蝦約90多萬(wàn)t，目前對(duì)蝦加工的產(chǎn)品主要是凍去頭蝦和蝦仁，在加工過(guò)程中產(chǎn)生了大量的蝦頭（約占原料的1/3）下腳料。研究表明，蝦頭含粗蛋白60%以上（干基），還含有豐富的礦物元素、胡蘿卜素和維生素B12等，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。對(duì)蝦的組織結(jié)構(gòu)獨(dú)特，內(nèi)臟位于頭部，分布有豐富的內(nèi)源酶，以活性或非活性的方式存在。這些分布于蝦頭組織的內(nèi)源酶分成兩種，一種是消化系統(tǒng)中的酶，另一種是存在于其它組織中的酶。據(jù)報(bào)道，蝦頭內(nèi)源酶主要是蛋白酶、酯酶、幾丁質(zhì)酶、多酚氧化酶等，多達(dá)幾十種［1］。水產(chǎn)品及其加工副產(chǎn)物組織在一定條件下由于內(nèi)源酶作用會(huì)發(fā)生自溶作用，內(nèi)源酶中的蛋白酶、肽酶會(huì)對(duì)組織蛋白質(zhì)產(chǎn)生降解作用，使蛋白質(zhì)從各組織中溶解出來(lái)，生成肽和氨基酸等產(chǎn)物［2］。研究亦顯示，借助自溶作用可較好地回收蝦頭中的蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分［3-4］。以南美白對(duì)蝦蝦頭為原料，對(duì)南美白對(duì)蝦蝦頭自溶酶的提取工藝條件進(jìn)行探討，研究結(jié)果將為后續(xù)南美白對(duì)蝦蝦頭內(nèi)源自溶酶的分離純化及鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮南美白對(duì)蝦蝦頭 由國(guó)聯(lián)水產(chǎn)公司提供；干酪素 生化試劑，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；血紅蛋白 購(gòu)自廣州齊云生物科技有限公司；蒸餾水 自制；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、鹽酸、氫氧化鈉 分析純，廣州化學(xué)試劑廠；福林酚試劑 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉優(yōu)級(jí)純，廣東光華化學(xué)廠有限公司。

FA2104S電子天平 上海精科天平；分析天平上海天平儀器廠；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-25型酸度計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠；SB-2000水浴鍋 上海愛(ài)朗儀器有限公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；島津UV2550紫外分光光度計(jì) 島津儀器有限公司；PHILIPS組織勻漿機(jī) 荷蘭飛利浦公司。

1.2 原料的預(yù)處理

新鮮南美白對(duì)蝦蝦頭進(jìn)行分裝，然后放在超低溫冷凍冰箱中進(jìn)行冷凍，冷凍好后放在-20℃下冷藏備用。

1.3 自溶蛋白酶酶活性的測(cè)定

1.3.1 酸性蛋白酶活性的測(cè)定［5-6］稱取0.5g血紅蛋白，用不同pH（2～6）的緩沖液配制成0.5%的血紅蛋白溶液，并用稀酸調(diào)節(jié)至所需的pH。加入2mL的血紅蛋白溶液、1mL的稀釋粗酶液室溫（27℃）下反應(yīng)15min，加入 3mL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，680nm處測(cè)吸光值。在室溫下每分鐘水解血紅蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。

1.3.2 堿性蛋白酶活性的測(cè)定［5］稱取0.5g酪蛋白為底物，用不同pH（7～10）的緩沖液配制成0.5%的酪蛋白溶液，并用稀堿調(diào)節(jié)至所需的pH。室溫下每分鐘水解的酪蛋白于三氯乙酸生成的不沉淀物（肽及氨基酸），在波長(zhǎng)680nm的吸光度與1μmol/L酪氨酸相當(dāng)?shù)拿噶繛?個(gè)酶活力單位。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.1 不同pH對(duì)蝦頭自溶酶活力的影響［7］稱取新鮮蝦頭20.0g，按料液比1∶3加入預(yù)冷的pH分別為2～10的0.05mol/L緩沖液（pH梯度為1），在組織勻漿器中冰浴勻漿2min，勻漿液置于4℃、10000r/min離心20min，收集上清液，在室溫（27℃）下進(jìn)行酶活力檢測(cè)。其他操作均在4℃下進(jìn)行。酶活的測(cè)定：酸性條件pH（2～6），利用血紅蛋白作為底物，堿性條件pH（7～10）利用酪蛋白作為底物，都在280nm處測(cè)得吸光度。1個(gè)酶活力單位相當(dāng)于在室溫下每分鐘分解血紅蛋白釋放1μg酪氨酸量。

1.4.2 不同溫度對(duì)蝦頭自溶酶活力的影響 分別以0.05mol/L pH3的磷酸氫二鈉-檸檬酸和0.05mol/L pH8的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液為提取液進(jìn)行打漿，勻漿液置于4℃、10000r/min離心20min，收集上清液，在溫度10～70℃（T梯度為10℃）進(jìn)行酶活力檢測(cè)。全部操作除特別說(shuō)明外，均在4℃下進(jìn)行。

1.4.3 不同料液比對(duì)蝦頭自溶酶活力的影響 分別以0.05mol/L pH3的磷酸氫二鈉-檸檬酸和0.05mol/L pH8的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液為提取液，分別以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的料液比與蝦頭組織混合勻漿，在室溫（27℃）下測(cè)定酶活力和蛋白濃度。

1.5 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取蝦頭自溶酶的主要影響因素是pH、溫度和料液比。因此，選擇pH、溫度和料液比作為考察因素，實(shí)驗(yàn)中不考慮交互作用影響，選擇L9（33）設(shè)計(jì)，確定最佳的蝦頭自溶酶提取的工藝條件。

1.6 自溶蛋白酶的初步分離

硫酸銨鹽析法不僅可以濃縮蛋白質(zhì)，還可以使蛋白質(zhì)的純度提高，另外鹽析可以除去RNA、DNA和脂類等雜質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)參考龍華、曾勇等所用方法并進(jìn)行改進(jìn)［8］。

在pH3和pH8的條件下，取粗酶液8份，每份50mL，分別加入研細(xì)的固體硫酸銨粉末至10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%飽和度，4℃靜置過(guò)夜后，離心（10000r/min，4℃，10min），取上清液，分別以5mmol/L pH3和pH8磷酸氫二鈉-檸檬酸和磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液透析24h，其間更換3～4次緩沖液。透析后離心（10000r/min，4℃，5min），取上清。對(duì)透析液進(jìn)行一定的稀釋，分別測(cè)定酶活力和蛋白質(zhì)含量。

1.7 相對(duì)酶活的表示

酸性、堿性蛋白酶相對(duì)酶活的表示是由不同的酸、堿性蛋白酶在最適條件下測(cè)得的酶活力設(shè)為100%，其他條件下測(cè)定的酶活力與最適酶活力的比值表示為相對(duì)酶活。

1.8 蛋白含量的測(cè)定

按Lowry法［9］和分光光度法［10］進(jìn)行測(cè)定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對(duì)蝦頭自溶蛋白酶活力的影響

從圖1中可以看出，蝦頭內(nèi)源酶中不僅含有酸性酶而且還含有堿性酶，并且酸性蛋白酶的酶活力相當(dāng)于堿性蛋白酶酶活的60%左右。蛋白酶活力在pH2～10之間，隨著pH的增加，酶活力先降低后增加。出現(xiàn)兩個(gè)活性峰，pH為2時(shí)，酶活力有一個(gè)高峰，隨著pH的增大酶活力開(kāi)始降低，這與Garciacarre?o.F.L等人研究魚的胃蛋白酶有些類似［11］，酸性蛋白酶在酸性條件下活性較高，隨著pH的增大自身酶活性可能受到抑制，蛋白發(fā)生變性，影響其酶活力。當(dāng)pH大于5時(shí)，蛋白酶活力迅速上升，在pH為8時(shí)，又出現(xiàn)一個(gè)活性峰，隨著pH的不斷增大蛋白酶活力開(kāi)始降低，有可能是蛋白在堿性條件很高時(shí)發(fā)生變性，導(dǎo)致蛋白酶受到抑制。

2.2 不同溫度對(duì)酸性、堿性蛋白酶酶活力的影響

從圖中可以看出，酸性蛋白酶酶活力在30℃時(shí)活性最高，隨著溫度的繼續(xù)上升酶活力下降，導(dǎo)致酶活力的下降可能是溫度太高使蛋白酶失活，在多數(shù)脊椎動(dòng)物中胃蛋白酶酶活力一般的最適溫度為25～45℃，劉忠義［12］研究發(fā)現(xiàn)草魚消化道酸性蛋白酶的最適溫度和pH為37℃和2。堿性蛋白酶酶活力在50℃左右時(shí)活性最高，10～50℃隨著溫度的上升酶活力增強(qiáng)，當(dāng)溫度超過(guò)50℃時(shí)，隨著溫度的上升酶活開(kāi)始降低。而對(duì)日本沼蝦肝胰腺堿性磷酸酶的研究中發(fā)現(xiàn)堿性酶的最適溫度為55℃［13］，陳清西［14］等人研究鱉魚腸道蛋白酶的最適條件為溫度37℃、pH8.0。

圖1 pH提取蝦頭內(nèi)源蛋白酶活力的影響

圖2 溫度對(duì)酸性、堿性蛋白酶酶活力的影響

2.3 料液比對(duì)酸性、堿性蛋白酶酶活的影響

從圖3中可以看出，當(dāng)料液比為1∶3時(shí)，堿性蛋白酶活力最大，當(dāng)料液比太小時(shí)，由于提取液的粘度大，不利于提取液的滲透和蛋白質(zhì)的溶解，因此，其蛋白酶活力較低。液料比過(guò)高，雖然能充分溶解活性物質(zhì)，但提取成本受到影響。陳清西［14］等人研究鱉魚腸道蛋白酶的最適料液比為1∶3。當(dāng)料液比為1∶2時(shí)，酸性蛋白酶活力最大，隨著料液比的增加，酶活力開(kāi)始降低。

圖3 料液比對(duì)堿性、酸性蛋白酶酶活的影響

2.4 正交實(shí)驗(yàn)分析提取工藝參數(shù)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，選取提取料液比、提取溫度、pH三個(gè)對(duì)酶活力影響最大的因素，對(duì)蝦頭組織中堿性、酸性蛋白酶提取工藝進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)分析，其具體實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表1和表2。

從正交實(shí)驗(yàn)直觀分析可知，以堿性蛋白酶的相對(duì)酶活為考察指標(biāo)，三個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響大小為：B＞A＞C，最佳提取條件為A3B2C2，即緩沖液pH為9.0、溫度50℃、料液比1∶3。這與本研究中單因素實(shí)驗(yàn)里面所確定的最適pH為8.0有沖突，為此又做了一個(gè)對(duì)比，將溫度、料液比都設(shè)定一樣50℃、1∶3。pH分別為 8.0和 9.0，得到的吸光度為 0.316和0.198；相對(duì)酶活分別為104.3%和65.35%。pH為8.0所測(cè)得的酶活較高。因此堿性蛋白酶提取的最佳條件為pH8.0、溫度50℃、料液比1∶3。

表1 堿性蛋白酶提取條件的正交實(shí)驗(yàn)

表2 酸性蛋白酶提取條件的正交實(shí)驗(yàn)

從正交實(shí)驗(yàn)直觀分析可知，以酸性蛋白酶相對(duì)酶活力為考察指標(biāo)，三個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響大小為：B＞C＞A，最佳提取條件為A2B1C1，在此正交實(shí)驗(yàn)中可以得出最佳的組合為pH3、料液比1∶1、溫度30℃。其中最小極差為pH的，所以pH為2或3都可以，由于單因素實(shí)驗(yàn)中料液比為1∶2最好，考慮到本實(shí)驗(yàn)中蝦頭中蛋白含量較高、打漿的難易程度、還有一些可溶性蛋白的溶解的程度，因此最佳提取條件為料液比1∶2、溫度30℃、pH3.0。

2.5 蝦頭組織內(nèi)源蛋白酶粗提液硫酸銨分級(jí)曲線

2.5.1 堿性蛋白酶硫酸銨分級(jí)曲線 由圖4顯示，當(dāng)用飽和度20%硫酸銨鹽析的上清液，其相對(duì)酶活力為100%，蛋白濃度OD值為0.304，說(shuō)明堿性蛋白酶及其它蛋白質(zhì)在20%飽和度硫酸銨溶解性最好；當(dāng)用飽和度80%硫酸銨鹽析的上清液，其相對(duì)酶活力為23.41%，蛋白濃度OD（700nm）值為0.036，則說(shuō)明上清液基本失去酶活力。由此可以確定，用飽和度20%硫酸銨溶解蛋白，再用飽和度80%硫酸銨離心回收蛋白酶，可以達(dá)到初步分離純化的效果。

圖4 蝦頭組織中堿性蛋白酶飽和硫酸銨分級(jí)曲線

2.5.2 酸性蛋白酶硫酸銨分級(jí)曲線 由圖5顯示，用飽和度10%硫酸銨鹽析的上清液，其相對(duì)酶活力為100%，達(dá)到最大，蛋白濃度OD值為0.814，說(shuō)明胃蛋白酶及其它蛋白質(zhì)在10%飽和度硫酸銨溶解性最好；用飽和度50%硫酸銨鹽析的上清液，其相對(duì)酶活力為1.82%，蛋白濃度OD值為0.355，這里蛋白含量高的原因是因?yàn)樵谶M(jìn)行堿性蛋白酶硫酸銨分級(jí)實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)透析液進(jìn)行了稀釋，在進(jìn)行酸性蛋白酶硫酸銨分級(jí)實(shí)驗(yàn)時(shí)，由于酸性蛋白酶的活性只相當(dāng)于堿性蛋白酶活性的60%左右，所以在此沒(méi)有稀釋，故蛋白含量和酶活力較高一些，雖然飽和度50%硫酸銨鹽析的上清液中蛋白含量還有一部分，但是由于上清液基本失去酶活，由此可以確定，用飽和度10%硫酸銨溶解蛋白，再用飽和度50%硫酸銨離心回收蛋白酶，可以達(dá)到初步分離純化的效果。

圖5 蝦頭組織中酸性蛋白酶飽和硫酸銨分級(jí)曲線

3 結(jié)論

3.1 由不同pH對(duì)南美白對(duì)蝦蝦頭自溶蛋白酶活力的影響，得到酸性、堿性蛋白酶兩個(gè)酶活力較高的活性峰，推斷蝦頭內(nèi)源酶中包含有酸性蛋白酶和堿性蛋白酶。

3.2 通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)蝦頭自溶蛋白酶提取工藝條件的研究，以蛋白酶酶活的吸光度（OD680nm）為考察指標(biāo)，優(yōu)選蝦頭自溶蛋白酶最佳提取工藝條件，堿性蛋白酶最佳的提取條件為：pH8、溫度50℃、料液比1∶3；酸性蛋白酶最佳的提取條件為：pH3、溫度30℃、料液比1∶2。

3.3 利用飽和硫酸銨分級(jí)沉淀法對(duì)自溶蛋白酶進(jìn)行初步分離，得到堿性蛋白酶硫酸銨一級(jí)沉淀飽和度20%，硫酸銨二級(jí)沉淀飽和度80%，純化率為1.149，得率為61.35%。酸性蛋白酶硫酸銨一級(jí)沉淀飽和度10%，硫酸銨二級(jí)沉淀飽和度50%，純化率為3.4，得率為66%。

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Study on extraction technology of protease from shrimp（Penaeus vannamei）head

ZHUANG Zhi-kai1，CHEN Kang-yu1，PENG Heng1，CAO Wen-hong1，GAO Jia-long1，LU Hong-yu1，CHI An-ying1，LAN Wei-bing1，JI Hong-wu2，*
（1.College of Food Science&Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China；2.Key Laboratory of Guangdong Higher Education Institutions for Advanced Processing of Aquatic Product，Zhanjiang 524088，China）

The research used Penaeus vannamei heads as materials and optimized extraction conditions.The impact of pH，temperature and solid-liquid ratio on the activity of endogenous protease was studied，and then the best condition to extract enzyme was contrived through orthogonal experiment.The optimal saturation was got using ammonium sulfate fractionation.The results indicated there were two peaks of enzyme activity，pH 2 and 8.The best condition to extract acidity protease by orthogonal experiment were：pH3，the ratio of solid-liquid of 1∶2，temperature 30℃.For the alkaline protease，experiment results showed that the optimum conditions were：pH8，the ratio of solid-liquid of 1∶3，temperature 50℃.For the acidity protease，preliminary separation results showed that ammonium sulfate in first class precipitation saturation was 10%and 50%in second.For the alkaline protease，preliminary separation results showed that ammonium sulfate in first class precipitation saturation was 20%and 80%in second.

Penaeus vanname；endogenous protease；extraction technology；parameter optimization；ammonium sulfate saturation

TS254.1

B

1002-0306（2010）12-0227-04

2009-11-17 *通訊聯(lián)系人

莊志凱（1987-），男，研究生，研究方向：水產(chǎn)品深加工及貯藏工程。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2007BAD29B09）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃和政策引導(dǎo)項(xiàng)目（2008BAD94B08）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2008A020100002）。