李紅霞，孫永科，李艷艷，徐昆龍

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，云南昆明650201）

普洱茶對(duì)原代小鼠肝細(xì)胞的毒性初探

李紅霞，孫永科，李艷艷，徐昆龍*

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，云南昆明650201）

以小鼠原代肝細(xì)胞為模型，研究不同濃度普洱茶對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞增殖率的影響、細(xì)胞凋亡及其細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，綜合評(píng)價(jià)普洱茶對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用，建立普洱茶細(xì)胞水平的安全性評(píng)價(jià)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：受試物普洱熟茶與普洱生茶IC50分別為6830、6459μg/mL，表明其對(duì)肝細(xì)胞毒性極小或無(wú)；細(xì)胞凋亡和電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察后顯示，當(dāng)茶樣濃度在1/16 IC50～I(xiàn)C50濃度范圍時(shí)，未見(jiàn)誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞發(fā)生凋亡；茶樣濃度達(dá)到IC50時(shí)，也未見(jiàn)對(duì)小鼠肝細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生有意義的病理?yè)p傷。因此，普洱生茶和熟茶對(duì)小鼠肝細(xì)胞的毒性極小或無(wú)，細(xì)胞毒理學(xué)研究表明飲用普洱茶是安全的。

普洱茶，原代小鼠肝細(xì)胞，細(xì)胞毒性

普洱茶是云南獨(dú)有的特產(chǎn)茶，特殊的原料、環(huán)境、工藝和貯藏條件賦予了普洱茶獨(dú)特的品質(zhì)，深受廣大消費(fèi)者的青睞［1-5］。鑒于普洱茶生產(chǎn)過(guò)程中存在一個(gè)微生物參與的特殊的渥堆發(fā)酵過(guò)程，增加了其成品生化成分和代謝產(chǎn)物的復(fù)雜性。近幾年，隨著普洱茶消費(fèi)人群越來(lái)越多，掀起了全國(guó)普洱茶熱。在這種趨勢(shì)下消費(fèi)者對(duì)純天然、高質(zhì)量、高品質(zhì)、無(wú)污染茶葉的需求也與日俱增。因此，人們也十分關(guān)注普洱茶飲用的安全性。迄今，國(guó)內(nèi)外對(duì)普洱茶的研究尚屬起步，對(duì)其安全性評(píng)價(jià)的研究處于滯后狀態(tài)，尤其對(duì)其復(fù)合成分的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)研究報(bào)道甚少。傳統(tǒng)動(dòng)物毒理學(xué)研究耗資大、時(shí)間長(zhǎng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對(duì)新的受試物進(jìn)行及時(shí)毒理學(xué)檢測(cè)的需要，同時(shí)受?chē)?guó)際動(dòng)物保護(hù)主義的影響，現(xiàn)今趨向用細(xì)胞進(jìn)行受試物的毒性檢驗(yàn)［6-7］，但普洱茶的細(xì)胞毒性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以臨滄市具有代表性的普洱生茶和熟茶為樣本，小鼠原代肝細(xì)胞為模型，檢測(cè)不同濃度普洱茶對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞增殖率的影響、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，綜合評(píng)價(jià)普洱茶對(duì)肝細(xì)胞的作用機(jī)制，對(duì)普洱茶進(jìn)行細(xì)胞水平的安全性評(píng)價(jià)，初步探討一種經(jīng)濟(jì)、適用、快速的普洱茶細(xì)胞毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法［8-9］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普洱熟茶與生茶 購(gòu)自云南臨滄千年古茶有限責(zé)任公司，生產(chǎn)日期：2007年7月，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：DB53/103-2006，衛(wèi)生許可證號(hào)：云衛(wèi)食證字（2006）第530902-000013；健康昆明種小鼠 由昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（滇）2005-0008；新生牛血清（GIBCO）、胰島素、Hoechst33342、琥珀酸脫氫酶（MTT）、Hepes Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；M199培養(yǎng)基、膠原酶IV型、胰蛋白酶-EDTA消化液 Invitrogen公司產(chǎn)品。

RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，HH.CP-01W 型二氧化碳培養(yǎng)箱，IX51型OLYMPUS熒光倒置顯微鏡等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶湯的制備

圖1 茶湯制備工藝流程

1.2.2 小鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng) 取成年小鼠10只，雌雄各半，合籠交配，飼喂繁殖飼料。在孕鼠即將分娩前1～2d，取出引頸處死，于超凈工作臺(tái)內(nèi)75%酒精中浸泡10s，剖腹取出胎鼠，將胎鼠中的肝組織放入無(wú)菌小燒杯，用D-Hank′s液洗2～3次，用眼科剪剪成1mm3大小的碎塊，PBS清洗3次，加入10倍體積的混合消化液，置37℃、體積百分比為5%的CO2培養(yǎng)箱中消化15min，加入含有10%小牛血清的M199終止消化，溫和振蕩后，將含有細(xì)胞的上清液經(jīng)3層紗布過(guò)濾后移入離心管，2000r/min離心4min，棄上清，加入DHank′s液反復(fù)清洗3次，用M199培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔48h換液一次［10］。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底85%左右，進(jìn)行細(xì)胞傳代。棄去上清液，用PBS液清洗細(xì)胞2次、加入0.25%胰酶消化1～2min，待細(xì)胞開(kāi)始收縮、變圓、折光度增強(qiáng)，細(xì)胞間出現(xiàn)空隙時(shí)，加入含10%小牛血清的完全培養(yǎng)基終止胰酶消化，吹打細(xì)胞約1～2次至細(xì)胞完全吹散后，分裝至2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每2d換全液1次，依此方法傳代［11-12］。

1.2.3 細(xì)胞增值率的測(cè)定 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠肝細(xì)胞按4000個(gè)/孔接種至96孔板，待細(xì)胞貼壁后把不同濃度受試物加入96孔板培養(yǎng)觀察24h，大致確定各受試物對(duì)細(xì)胞的最大致死濃度范圍。收集對(duì)數(shù)期小鼠肝細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔100μL接種至96孔板中央62孔內(nèi)（邊緣32孔作調(diào)零孔），使待測(cè)細(xì)胞密度4000個(gè)/孔，放入CO2培養(yǎng)箱。待細(xì)胞貼壁后，吸出原培養(yǎng)基，第2和第11排加普通培養(yǎng)液做空白對(duì)照，第3至第10排每孔加100μL不同濃度受試物，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。加入受試物48h后每孔加入10μL MTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入200μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)量各孔吸光度A值，每一濃度的A值均為6孔的平均值，將得到的A值按如下公式換算成細(xì)胞增殖率：

細(xì)胞增殖率（%）=（給藥組平均A值/對(duì)照組平均A值）×100%

IC50計(jì)算公式：

lgIC50=Xm-I［P-（3-Pm-Pn）/4］

細(xì)胞抑制率（%）=（1-給藥組平均A值/對(duì)照組平均A值）×100%

式中：Xm-lg最大劑量；I-lg（最大劑量/相臨劑量）；P-陽(yáng)性反應(yīng)率之和；Pm-最大陽(yáng)性反應(yīng)率；Pn-最小陽(yáng)性反應(yīng)率；公式中最大最小陽(yáng)性反應(yīng)率就是最大最小抑制率。

評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)美國(guó)藥典中［13］所述的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)分別對(duì)細(xì)胞毒性分級(jí)、細(xì)胞毒性相對(duì)增殖率與細(xì)胞毒性的分級(jí)，見(jiàn)表1。

表1 細(xì)胞相對(duì)增殖率與細(xì)胞毒性的分級(jí)

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)期小鼠肝細(xì)胞，計(jì)數(shù)，按每孔2×105接種于6孔板，放入37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。參考相關(guān)研究的劑量選擇［14］，熟茶和生茶按濃度為IC50、1/4 IC50、1/16 IC503個(gè)劑量組的受試樣品分別加入6孔板，同時(shí)做陰性對(duì)照。染色作用24h后取出用PBS洗凈上層培養(yǎng)基、棄上清，加入Hoechst33342（終濃度10μg/mL），37℃避光孵育30min。將經(jīng)過(guò)Hoechst 33342染色后的6孔板置熒光顯微鏡下，在波長(zhǎng)為510nm下觀察細(xì)胞核熒光形態(tài)［10］。

1.2.5 電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肝細(xì)胞，用含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基稀釋成1× 104/mL的細(xì)胞懸液，分別接種于7個(gè)培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%時(shí)，以熟茶和生茶終濃度為IC50劑量作用細(xì)胞24h（并設(shè)陰性對(duì)照），0.25%胰酶消化，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗2次，高速離心形成細(xì)胞團(tuán)，將細(xì)胞團(tuán)塊懸浮于2.5%戊二醛固定液中送檢，然后將各組數(shù)據(jù)用SAS6.12軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)

剪碎的組織塊經(jīng)消化液消化后，鏡下可見(jiàn)到大量單個(gè)細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)瓶中，過(guò)濾離心，接種后6～12h即可部分貼壁，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，胞漿透亮，細(xì)胞密度較小，尚未伸展。用臺(tái)盼藍(lán)拒染計(jì)數(shù)顯示，85%細(xì)胞排斥染色。20～48h后觀察，已有許多細(xì)胞貼壁，并開(kāi)始伸展，細(xì)胞形狀不規(guī)則。大約5～7d后，細(xì)胞已匯合成單層鋪滿瓶底，多呈菱形與梭狀，見(jiàn)圖2所示。

培養(yǎng)的小鼠原代肝細(xì)胞在電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞間毛細(xì)膽管，玫瑰花瓣樣糖原顆粒、車(chē)輪狀線粒體、大量粗、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，符合肝細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.2 不同濃度茶湯對(duì)小鼠肝細(xì)胞增殖率的影響

從表2可以看出，茶湯濃度在125～500μg/mL時(shí)，細(xì)胞相對(duì)增殖率與對(duì)照組差異不顯著，根據(jù)細(xì)胞毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬1級(jí)毒性，為合格的反應(yīng)物。茶湯濃度在1000和2000μg/mL時(shí)，與對(duì)照組差異顯著，但細(xì)胞的相對(duì)增殖率75%以上，也屬于反應(yīng)合格的濃度范圍。高濃度的茶湯（4000～16000μg/mL）細(xì)胞增殖率與對(duì)照組差異極顯著。

表2 茶湯對(duì)小鼠肝細(xì)胞增殖率的影響

圖2 小鼠原代肝細(xì)胞（10×）

2.3 細(xì)胞IC50統(tǒng)計(jì)結(jié)果

根據(jù)歐盟國(guó)家實(shí)驗(yàn)室藥物毒性判定標(biāo)準(zhǔn)（IC50≥1500μg/mL，細(xì)胞毒性極小或無(wú)）。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的熟茶與生茶IC50分別為6830、6459μg/mL，兩者均大于1500μg/mL，說(shuō)明普洱茶對(duì)小鼠肝細(xì)胞毒性極小或無(wú)，從細(xì)胞水平上，證實(shí)了普洱茶的飲用安全性。

表3 受試物對(duì)細(xì)胞的半抑制濃度IC50值（μg/mL）

2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)MTT測(cè)定結(jié)果，以熟茶與生茶終濃度為IC50、1/4 IC50、1/16 IC503個(gè)劑量組進(jìn)行Hoechst33342染色法觀察細(xì)胞凋亡，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可以看出，不同濃度茶湯作用細(xì)胞后經(jīng)Hoechst33342染色，細(xì)胞核呈彌散均勻的藍(lán)色熒光，染色質(zhì)較均勻分布。沒(méi)有出現(xiàn)核固縮、核破碎塊狀或產(chǎn)生凋亡小體，與對(duì)照組沒(méi)有形態(tài)學(xué)上的差異，由此可以判定茶湯濃度在1/16 IC50～I(xiàn)C50劑量范圍內(nèi)，未見(jiàn)誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.5 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

將熟茶與生茶IC50時(shí)的濃度作用于肝細(xì)胞，在透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，同時(shí)做陰性對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖4所示。

陰性對(duì)照組（圖4A）肝細(xì)胞體積大小正常，細(xì)胞核染色質(zhì)均勻分布，核膜完整，無(wú)變形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體，線粒體嵴較完整，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)脫顆?，F(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)組圖4B與圖4C，肝細(xì)胞體積正常，細(xì)胞核染色質(zhì)較均勻分布，細(xì)胞質(zhì)中各細(xì)胞器無(wú)明顯變化，線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體積數(shù)量均正常。

圖3 Hoechst33342染色結(jié)果（40×）

圖4 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

3 討論

肝臟是機(jī)體主要解毒器官之一，外源性化合物對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用主要表現(xiàn)在組織細(xì)胞的凋亡和超微結(jié)構(gòu)的改變。1972年Kerr提出“細(xì)胞凋亡主要形態(tài)表現(xiàn)在細(xì)胞核染色質(zhì)的凝集”，這至今仍是檢測(cè)凋亡細(xì)胞的形態(tài)指標(biāo)。在細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)中，線粒體是提供各種細(xì)胞活動(dòng)所需要的化學(xué)能量，是產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)主要能量來(lái)源的細(xì)胞器，當(dāng)它的損傷超過(guò)一定限度，細(xì)胞就會(huì)衰老死亡。此外，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中合成蛋白質(zhì)的主要場(chǎng)所，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表面附著大量核糖體顆粒，因此，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量及形態(tài)的改變標(biāo)志著細(xì)胞衰老、損傷，甚至惡化的程度。細(xì)胞凋亡研究表明，普洱生茶和普洱熟茶茶樣濃度在1/16 IC50～I(xiàn)C50之間時(shí)，不會(huì)誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。電鏡結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的肝細(xì)胞體積正常，細(xì)胞核和細(xì)胞器保存良好，接近正常對(duì)照組肝細(xì)胞的形態(tài)?？梢?jiàn)，普洱生茶和普洱熟茶茶樣的IC50濃度不會(huì)損傷小鼠肝細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化。從細(xì)胞凋亡檢測(cè)與電鏡超微結(jié)構(gòu)變化結(jié)果證實(shí)，普洱生茶和普洱熟茶茶樣對(duì)小鼠的肝細(xì)胞沒(méi)有實(shí)質(zhì)性毒性作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，普洱熟茶與生茶對(duì)小鼠肝細(xì)胞半抑制濃度（IC50）分別為6830、6459μg/mL，對(duì)細(xì)胞毒性極小或無(wú)。茶樣濃度在1/16 IC50～I(xiàn)C50濃度范圍內(nèi)，不誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。茶樣濃度為IC50時(shí)，也不會(huì)對(duì)小鼠肝細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生有意義的病理?yè)p傷，因此，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平上證實(shí)了普洱茶飲用的安全性。

［1］中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22111—2008［S］.地理標(biāo)志產(chǎn)品普洱茶.

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Preliminary study on Pu’er tea influencing mouse primary hepatocyte in cytotoxicity

LI Hong-xia，SUN Yong-ke，LI Yan-yan，XU Kun-long*
（Faculty of Animal Science，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China）

ln this study，the mice primary hepatocyte culture was used to study the cytotoxicity，cells apoptosis，and cell ultrastructure was observed by transmission electron microscopic.Cytotoxicity by the Pu′er tea was synthetically evaluated，safety assessment methods on cell level of the Pu′er tea was established.The results showed that lC50of Pu′er mature tea and raw tea was 6830，6459μg/mL separately.The test substance cytotoxicity was small or not.lC50of tea polyphenol monomer and caffeine monomer results showed that they were the main factors of inhibit cell proliferation.According to observation of cells apoptosis and cell ultrastructure，between 1/16 lC50tea concentration and lC50of tea concentration，exerted no induce mice hepatocyte apoptosis.When tea concentration was up to lC50，no meaningful of pathological injury was exerted.The cytotoxicity of two samples was very small or not.Cells toxicity test completely applied to safety evaluation of Pu’er tea.

Pu’er tea；mouse primary hepatocyte；cytotoxicity

TS201.4

A

1002-0306（2010）12-0322-04

2010-06-17 *通訊聯(lián)系人

李紅霞（1982-），女，碩士研究生，主要從事食品質(zhì)量與安全方面的研究。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2007BAD58B05）。