趙 爽，劉 宇，王守現(xiàn)，王賀祥，許 峰，耿曉麗，孟莉莉

（1.北京農(nóng)林科學(xué)院植保環(huán)保研究所，北京100097；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

不同品種姬松茸菌絲體蛋白質(zhì)和水溶性多糖含量的研究

趙 爽1，劉 宇1，王守現(xiàn)1，王賀祥2，許 峰1，耿曉麗1，孟莉莉1

（1.北京農(nóng)林科學(xué)院植保環(huán)保研究所，北京100097；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

研究目的在于篩選出性質(zhì)優(yōu)良的姬松茸品種。首先對本實(shí)驗(yàn)室保藏的姬松茸4個品種進(jìn)行了菌絲發(fā)酵，并通過二奎林甲酸（BCA）檢測法和苯酚-硫酸法測定了菌絲體的蛋白質(zhì)和水溶性多糖含量。結(jié)果表明：姬松茸7號的蛋白質(zhì)含量占菌絲體鮮重的5.41%，其水溶性多糖含量占菌絲體干重的1.499%，是4個品種中蛋白和多糖含量相對較高的品種，值得對其進(jìn)行深度開發(fā)。

姬松茸，蛋白質(zhì)，水溶性多糖，二奎林甲酸（BCA），苯酚-硫酸法

姬松茸（Agaricus blazei）隸屬于擔(dān)子菌門，層菌綱，傘菌目，蘑菇科，蘑菇屬，是一種藥食兼用的珍稀食用菌。姬松茸含有豐富的蛋白質(zhì)、核酸、多糖類、甾醇、維生素等多種生物活性物質(zhì)，營養(yǎng)價值極高，同時具有多種藥理功能，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖、對環(huán)磷酰胺誘發(fā)損傷的拮抗和修復(fù)作用、抗病毒、護(hù)肝，此外還具有一定的防護(hù)輻射能力，能削弱紫外線對機(jī)體的損傷，降低疾病突變率等［1-5］。而姬松茸的調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤等藥用功效來源于上述多種生理活性物質(zhì)［6］，尤其是姬松茸多糖和多糖蛋白復(fù)合體更是成為了目前研究的重點(diǎn)。本研究的目的在于對本實(shí)驗(yàn)室保藏的4個姬松茸菌株進(jìn)行深層發(fā)酵，測定菌絲體中蛋白質(zhì)和水溶性多糖的含量，以評價4個品種的營養(yǎng)含量，確定下一步開展姬松茸栽培的高品質(zhì)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試的四個姬松茸（Agaricus blazei）菌株 本實(shí)驗(yàn)室保藏，分別為姬松茸、姬松茸（巴西）、姬松茸7號和姬松茸11號，其中姬松茸和姬松茸（巴西）為本實(shí)驗(yàn)室從子實(shí)體中分離得到，姬松茸7號和姬松茸11號由福建省農(nóng)科院土壤肥料研究所微生物室提供；綜合PDA培養(yǎng)基 200g馬鈴薯、20g葡萄糖、20g瓊脂粉（北京夢怡美公司）、3g KH2PO4、10mg VB1（湖北華中藥業(yè)）、5g蛋白胨（北京奧博星公司，總氮＞9%、氨基氮＞3%）、1.5g MgSO4、1000mL蒸餾水；綜合PD液體培養(yǎng)基 上述培養(yǎng)基不添加瓊脂粉；BCA蛋白定量試劑盒 購于北京博邁德科技公司；苯酚、濃硫酸、NaCl、乙醇以及其它試劑 均為分析純，購自北京化學(xué)試劑公司。

表1 4種姬松茸菌絲含量的測定結(jié)果

生物安全柜MSC 1.2 美國Thermo公司；全波長酶標(biāo)儀VERSA max 美國Molecular Devices公司；精密天平AR2140 美國奧豪斯公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA 上海振捷公司；恒溫培養(yǎng)搖床HZQ-F160 江蘇太倉公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及培養(yǎng) 將4種姬松茸斜面菌株接種到綜合PDA平板上進(jìn)行活化，25℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲長滿平板后將其接種到液體培養(yǎng)基中，25℃160r/min搖瓶培養(yǎng)7d后，再轉(zhuǎn)接一次液體搖瓶培養(yǎng)7d后收集菌絲體，存于-20℃冰箱內(nèi)待用。

1.2.2 菌絲體蛋白質(zhì)含量的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：利用標(biāo)準(zhǔn)樣品小牛血清蛋白（BSA）配制成25、50、100、200、300、400μg/mL的溶液，采用BCA蛋白定量試劑盒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取4個品種的菌絲體各0.1g，加入10mL生理鹽水，研磨至組織破碎后，4℃浸提3h，12000r/min離心10min，取上清，即為粗蛋白提取液。將蛋白提取液進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶荻认♂尯蟛捎肂CA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 菌絲體水溶性多糖含量的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：采用苯酚-硫酸法［7］，將葡萄糖105℃烘干至恒重，配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL的溶液，加入6%苯酚（重蒸）溶液和濃硫酸，迅速振搖混勻，于室溫下靜置15min后，100℃水浴30min，混勻，迅速冷卻，用酶標(biāo)儀在492nm波長處分別測定吸光度。

取4個品種的菌絲體65℃烘干至恒重，精密稱取各2g加入40mL蒸餾水，90℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)抽提3h，收集提取液加入4倍體積的無水乙醇進(jìn)行多糖沉淀12h，離心收集沉淀后再次用蒸餾水溶解，配制成不同濃度的樣品溶液，采用苯酚-硫酸法測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

本研究測定了4個姬松茸菌株之間的蛋白質(zhì)含量和水溶性多糖含量的差異，是目前對姬松茸不同品種測定的首次報(bào)道。通過本研究的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了營養(yǎng)價值較高的姬松茸菌株，為其大面積推廣提供了可靠的依據(jù)。

蛋白質(zhì)和葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1和圖2。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得出，蛋白質(zhì)含量的線性方程為Y=0.0029X，R2=0.9907，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量在50～400μg/mL范圍內(nèi)，溶液蛋白濃度與562nm處吸光值呈現(xiàn)一次線性關(guān)系；葡萄糖含量的線性方程為Y=9.9193X，R2= 0.9986，當(dāng)葡萄糖含量在0～0.14mg/mL的范圍內(nèi)，溶液葡萄糖濃度與492nm處吸光值呈現(xiàn)一次線性關(guān)系。因此制備待測樣品時，需要使樣品濃度在線性區(qū)間內(nèi)，才能保證測定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

圖1 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 樣品含量的測定

根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒和苯酚-硫酸法測定4種姬松茸菌絲中蛋白質(zhì)和水溶性多糖含量的結(jié)果見表1。

通過測定比較發(fā)現(xiàn)：姬松茸7號和姬松茸11號兩個品種的蛋白質(zhì)含量分別占到菌絲體鮮重的5.41%和5.49%，分別是姬松茸（巴西）品種的2.09倍和2.12倍，姬松茸品種的2.21倍和2.24倍，與姬松茸品種的數(shù)據(jù)比較達(dá)到顯著性差異的程度。在水溶性多糖含量比較中發(fā)現(xiàn)，姬松茸（巴西）和姬松茸7號兩個品種的多糖含量較之其它兩個品種高，分別為菌絲體干重的1.44%和1.499%，與姬松茸11號的數(shù)據(jù)相比較，其它姬松茸3個品種均未達(dá)到顯著性差異的程度。

3 結(jié)論

利用BCA蛋白定量檢測法和苯酚-硫酸法對姬松茸、姬松茸（巴西）、姬松茸7號和姬松茸11號4個品種發(fā)酵7d的菌絲體進(jìn)行蛋白質(zhì)和水溶性多糖含量的測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：姬松茸7號和姬松茸11號是兩種蛋白質(zhì)含量較高的品種，姬松茸（巴西）和姬松茸7號是水溶性多糖含量較高的兩個品種。通過本研究的數(shù)據(jù)得知，姬松茸7號是4個品種當(dāng)中營養(yǎng)成分較高的優(yōu)勢品種，下一步的研究就可以立足于開發(fā)姬松茸7號子實(shí)體的栽培。

［1］張蓉嬌，吳天祥.姬松茸多糖及其生物活性研究進(jìn)展［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（6）：108-110.

［2］李娜，張靜，徐仲偉，等.姬松茸研究現(xiàn)狀與展望［J］.食品研究與開發(fā)，2009，30（7）：166-169.

［3］樊廷俊，錢冠蘭，杜玉堂，等.姬松茸提取物組分體外抗病毒感染活性的研究［J］.中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，38（5）：775-780.

［4］Mizuno M，Morimoto M，Minato KI，et al.Polysaccharides from Agaricus blazei Stimulate Lymphocyte T-Cell Subsets in Mice［J］.Bioscience Biotechnology，and Biochemistry，1998，62： 434-437.

［5］Mizuno M，Minato KI，Ito H，et al.Anti-tumor polysaccharide from the mycelium of liquid-cultured Agaricus blazei mill［J］. IUBMB Life，1999，47（4）：707-714.

［6］張卉，劉長江.姬松茸（Agaricus blazei Murill）生理活性物質(zhì)的研究進(jìn)展［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，34（1）：59-62.

［7］張惟杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1987：7-10.

Study on content of protein and hydrophilic polysaccharide in mycelium of different Agaricus blazei strains

ZHAO Shuang1，LIU Yu1，WANG Shou-xian1，WANG He-xiang2，XU Feng1，GENG Xiao-li1，MENG Li-li1
（1.Institute of Plant and Environment Protection，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China；2.State Key Laboratory for Agrobiotechnology and Department of Microbiology，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

The aim of this research is to select advanced strains of Agaricus blazei.Firstly，four strains of Agaricus blazei were chosen，which were available in our lab，as the research objects.The content of protein and hydrophilic polysaccharide in mycelium during the submerged fermentation period were studied in this research by bicinchoninic acid（BCA）method and phenol-sulphuric acid method.The results showed that Agaricus blazei No.7 strain was the most valuable strain as compared to the other three strains in terms of nutritional value.lt contained protein and hydrophilic polysaccharide，which were equal to 5.41%of fresh mycelium weight and 1.499%of dry mycelium weight，respectively.All in all，it should be developed in future due to its nutritional value.

Agaricus blazei；protein；hydrophilic polysaccharide；bicinchoninic acid（BCA）；phenol-sulphuric acid method

TS201.3

A

1002-0306（2010）12-0121-03

2009-12-15 *通訊聯(lián)系人

趙爽（1982-），女，博士，助理研究員，從事食用菌產(chǎn)品加工方向的研究。

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2007BAD89B07）。