陳 霞，姜曉雷，李明達(dá)，韓 丹，莫新迎，石維忱，趙長新，*

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，遼寧大連116034；2.中國發(fā)酵工業(yè)協(xié)會，北京100833）

離子強(qiáng)度和PH對大麥中熱穩(wěn)定蛋白穩(wěn)定性的影響

陳 霞1，姜曉雷1，李明達(dá)1，韓 丹1，莫新迎1，石維忱2，趙長新1，*

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，遼寧大連116034；2.中國發(fā)酵工業(yè)協(xié)會，北京100833）

大麥中的熱穩(wěn)定蛋白對啤酒的非生物穩(wěn)定性以及啤酒的冷渾濁都有著重要的影響。本實(shí)驗(yàn)利用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）和SDS-PAGE電泳技術(shù)對pH和離子強(qiáng)度改變后的大麥中的熱穩(wěn)定蛋白的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH及離子強(qiáng)度對熱穩(wěn)定蛋白的穩(wěn)定性均有較大的影響，堿性環(huán)境比酸性環(huán)境對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性影響大；離子強(qiáng)度與熱穩(wěn)定蛋白穩(wěn)定性之間成負(fù)相關(guān)；隨著離子價態(tài)的升高，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性隨著降低。本研究為熱穩(wěn)定蛋白特性的研究提供可靠的參數(shù)，同時為啤酒生產(chǎn)有針對性的改進(jìn)提供參考。

大麥，熱穩(wěn)定蛋白，離子強(qiáng)度

泡沫的豐富和細(xì)膩是啤酒最直接的感官評價，促進(jìn)啤酒泡沫生成和維持泡沫持久的物質(zhì)是大麥中的熱穩(wěn)定蛋白［1］，這部分蛋白質(zhì)經(jīng)過發(fā)芽、糖化以及煮沸發(fā)酵等過程后仍然得以保存［2-3］，它還能夠決定啤酒的口感風(fēng)味及膠體的穩(wěn)定性，是決定麥芽和啤酒品質(zhì)的重要因素［3-5］。大麥?zhǔn)瞧【粕a(chǎn)的主要原料，使用相同品種的大麥在不同工藝條件下釀造的啤酒，泡沫特性存在很大差異，在制麥和啤酒生產(chǎn)過程中，pH、溫度、外源添加物等一部分因素對大麥熱穩(wěn)定蛋白的空間結(jié)構(gòu)、分子內(nèi)氫鍵和疏水性都產(chǎn)生了影響，從而使熱穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了相應(yīng)的改變，同時物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)也發(fā)生了巨大變化，導(dǎo)致其穩(wěn)定性下降，含量及組成均出現(xiàn)減少［6］。以往國內(nèi)外科研機(jī)構(gòu)和相關(guān)研究部門都是對大麥、麥芽和啤酒中的熱穩(wěn)定蛋白含量及生化特性進(jìn)行研究，基本上沒有對熱穩(wěn)定蛋白的穩(wěn)定特性進(jìn)行分析［7］，而事實(shí)上無論在制麥還是啤酒釀造過程中，其環(huán)境因素對大麥中熱穩(wěn)定蛋白的穩(wěn)定性都存在一定的影響，使熱穩(wěn)定蛋白變性失活，導(dǎo)致其含量下降，從而影響啤酒的品質(zhì)。本文通過改變pH和鹽溶液濃度對大麥中熱穩(wěn)定蛋白穩(wěn)定性進(jìn)行研究，對大麥熱穩(wěn)定蛋白特性和啤酒品質(zhì)的關(guān)系做了較全面系統(tǒng)的分析，為啤酒生產(chǎn)中提高啤酒泡沫穩(wěn)定性起到一定的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大麥 Baudin（澳大利亞產(chǎn)），由中糧麥芽（大連）有限公司惠贈；SDS-PAGE低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)Takala公司；考馬斯亮藍(lán)G250/R250、牛血清白蛋白、丙烯酰胺、甘氨酸 Amresco；DTT Merk；EDTA ·Na2Sigma；其余試劑 均為分析純。

ZPS-250H智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱 黑龍江東拓儀器制造有限公司；Unic-7200分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；JM-250型小型電泳儀 大連捷邁科貿(mào)有限公司；GTL-16A離心機(jī) 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；pH計(jì) Mettler-Toledo Delta320；可調(diào)萬用電爐 山東省龍口市先科儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)的提取 大麥用干磨機(jī)磨碎3min，準(zhǔn)確稱取磨碎的大麥（扣除水分后的絕干重量），按料液比1∶2.5（g/mL）分別加入4℃提取緩沖液［8］（Tris-Cl 50mmol·L-1，NaCl 10mmol·L-1，DTT 1mmol·L-1，EDTA·Na21mmol·L-1，pH7.5），搖勻，置4℃提取1h，其間每10min搖振一次。4000r/min離心10min，收集上清液。再次向沉淀中按料液比1∶2.5（g/mL）加入4℃提取緩沖液，搖勻，置4℃提取1h，4000r/min離心10min，合并兩次浸提的上清液，得蛋白粗提液。將此粗提液于100℃水浴20min，之后4000r/min離心10min，棄去沉淀，所得上清液為熱穩(wěn)定蛋白提取液。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測定 采用Bradford法，使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白［9］。

在試管中分別加入牛血清蛋白濃度為0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mg/mL的蛋白溶液（以下步驟做兩組平行實(shí)驗(yàn)），從以上蛋白溶液中分別取0.1mL置于8個試管中，再分別加入5mL考馬斯亮藍(lán)工作液，搖勻后靜置5min后，在595nm處測其吸光值。計(jì)算兩組平行實(shí)驗(yàn)測得的吸光值的平均值作圖1。

圖1 Bradford法測蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 離子強(qiáng)度和pH對熱穩(wěn)定蛋白的影響實(shí)驗(yàn)將1.2.1收集到的熱穩(wěn)定蛋白提取液，按照每份5mL分成20等份裝入試管中。

1.2.3.1 離子強(qiáng)度對熱穩(wěn)定蛋白的影響實(shí)驗(yàn) 取12支裝有熱穩(wěn)定蛋白的試管，向試管中添加NaCl和CaCl2，使試管中兩種金屬鹽濃度分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%。將溶液搖勻靜置 20min后，4000r/min離心15min，收集清液，按照1.2.2方法確定的方程計(jì)算蛋白濃度并測量體積，其余上清液留樣待用。

1.2.3.2 pH對熱穩(wěn)定蛋白的影響實(shí)驗(yàn) 取9支裝有熱穩(wěn)定蛋白的試管，用HCl及NaOH將溶液調(diào)成pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0及用pH計(jì)測量提取液中pH。將調(diào)好pH的溶液搖勻，靜置20min后，4000r/min離心15min，收集清液，按照1.2.2方法確定的方程計(jì)算蛋白濃度并測量體積，其余上清液留樣待用。

1.2.4 SDS-PAGE 使用 LaemmLi不連續(xù)系統(tǒng)在4℃進(jìn)行電泳，12%分離膠（80×80×1mm），5%濃縮膠（80×8×1mm）。凝膠使用考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同環(huán)境下熱穩(wěn)定蛋白含量的變化

2.1.1 不同pH條件下熱穩(wěn)定蛋白含量及其變化趨勢 如圖2所示，原蛋白提取液pH7.0時蛋白質(zhì)含量最高（為3.27mg），隨著pH條件的改變，蛋白質(zhì)含量的變化顯著。當(dāng)pH為3.0～7.0時，其蛋白質(zhì)含量與pH呈正相關(guān)，而當(dāng)pH為7.0～9.0時，蛋白質(zhì)含量與pH呈負(fù)相關(guān)。從圖中可以看出，pH對熱穩(wěn)定蛋白的影響很大，由于每一種蛋白質(zhì)都有最適合的pH沉淀點(diǎn)，在這個范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的靜電力最小，蛋白質(zhì)彼此間交聯(lián)引力大于分子間的斥力，從而使得保留下來的蛋白質(zhì)含量變少。

圖2 大麥熱穩(wěn)定蛋白含量隨pH改變的變化

2.1.2 不同鹽溶液濃度條件下熱穩(wěn)定蛋白含量及其變化趨勢 如圖3所示，鹽溶液濃度對大麥中熱穩(wěn)定蛋白含量的影響較大，蛋白質(zhì)含量的變化與鹽溶液濃度呈負(fù)相關(guān)，即大麥中熱穩(wěn)定蛋白的含量隨離子強(qiáng)度的增加反而減少。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因有可能是鹽溶液濃度升高，溶液中離子強(qiáng)度增加，極性增強(qiáng)，使溶液中蛋白質(zhì)的疏水鏈彼此間作用力減弱，蛋白質(zhì)逐漸自聚形成疏水鏈朝內(nèi)的結(jié)構(gòu)，從而蛋白質(zhì)發(fā)生“鹽析”現(xiàn)象，含量下降。對比圖中兩種鹽溶液對熱穩(wěn)定蛋白的影響，可以發(fā)現(xiàn)其鈣鹽的影響較大，鈣離子影響蛋白質(zhì)的減少量是鈉離子影響的1.5～2.0倍左右，當(dāng)離子強(qiáng)度影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)時，通常的情況下，無機(jī)鹽都會促進(jìn)反應(yīng)向混濁沉淀的方向發(fā)展，主要是通過離子強(qiáng)度對蛋白質(zhì)的疏水作用而促進(jìn)混濁反應(yīng)的進(jìn)行，從而說明其離子價態(tài)對蛋白質(zhì)變性存在一定關(guān)系。

圖3 大麥熱穩(wěn)定蛋白含量隨鹽溶液濃度變化的改變

由以上兩種環(huán)境下熱穩(wěn)定蛋白含量均發(fā)生減少的現(xiàn)象推測，熱穩(wěn)定蛋白中某些蛋白質(zhì)在環(huán)境改變時發(fā)生了變性，導(dǎo)致熱穩(wěn)定蛋白總含量下降。

2.2 不同pH和鹽溶液濃度環(huán)境下大麥熱穩(wěn)定蛋白SDS-PAGE圖譜分析

熱穩(wěn)定蛋白的穩(wěn)定性與維持熱穩(wěn)定蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)的分子間和分子內(nèi)的氫鍵有著密切的聯(lián)系，同時還與其本身具有較強(qiáng)疏水性有關(guān)。當(dāng)pH及離子強(qiáng)度改變時，蛋白質(zhì)表面的疏水結(jié)構(gòu)受到影響，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)的改變，同時熱穩(wěn)定蛋白的物理化學(xué)特性發(fā)生巨大改變，熱穩(wěn)定蛋白變性，穩(wěn)定性也發(fā)生變化。

從圖4可以看出，隨著pH的改變，大麥中的熱穩(wěn)定蛋白條帶的顏色也發(fā)生了相應(yīng)地變化。pH7.0與pH6.7條帶最為接近，由pH7.0向兩端泳道上的蛋白質(zhì)條帶發(fā)生了減少缺失的現(xiàn)象，當(dāng)pH4.0和pH8.0時，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性受到的影響最大，蛋白質(zhì)條帶顏色變淡甚至消失，至pH3.0和pH9.0時條帶基本全部消失，由此說明pH環(huán)境的改變使蛋白質(zhì)發(fā)生了變性沉淀，從而消失。

圖4 不同pH條件下熱穩(wěn)定蛋白SDS-PAGE圖譜分析

圖5 不同鈉鹽濃度環(huán)境下熱穩(wěn)定蛋白SDS-PAGE圖譜分析

如圖5、圖6所示，隨著鹽溶液濃度的升高，蛋白質(zhì)條帶顏色逐漸變淡且逐漸減少。在鈉鹽的單一溶液體系，溶液濃度升高，分子量90、44.3kDa左右的蛋白質(zhì)消失最快，當(dāng)鹽溶液濃度為3%時條帶消失最多，9%后蛋白條帶基本消失，說明這部分蛋白質(zhì)受離子強(qiáng)度影響最大。在鈣鹽的單一溶液體系中，除分子量27kDa和23kDa左右的蛋白條帶外，其他條帶消失地都很快，與鈉鹽中受離子強(qiáng)度影響大的蛋白質(zhì)是相同的，溶液濃度3%時蛋白質(zhì)條帶開始大量減少，7%以后條帶基本消失，即蛋白質(zhì)基本變性失活。綜合熱穩(wěn)定蛋白受兩種離子強(qiáng)度影響的SDS-PAGE譜圖及其含量變化圖可知，鈣鹽溶液對熱穩(wěn)定蛋白的影響較大，其蛋白質(zhì)含量減少速度高于鈉鹽，蛋白質(zhì)條帶的消失也要比鈉鹽早。以上說明鹽溶液中離子的價態(tài)對蛋白質(zhì)影響較大，在離子強(qiáng)度和溶解度降低的雙重作用下蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)作用力減弱，斥力增加而解體成單個分子，其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而被“鹽析”出來。因此，離子強(qiáng)度越大，發(fā)生變性的速度越快。

圖6 不同鈣鹽濃度環(huán)境下熱穩(wěn)定蛋白SDS-PAGE圖譜分析

3 結(jié)論

通過考察不同的pH環(huán)境及金屬離子對大麥中熱穩(wěn)定蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)pH及離子強(qiáng)度的改變均對熱穩(wěn)定蛋白的穩(wěn)定性影響較大。其中熱穩(wěn)定蛋白的穩(wěn)定性隨環(huán)境的酸性和堿性增強(qiáng)而減弱，堿性環(huán)境對蛋白的穩(wěn)定性影響較大。離子強(qiáng)度對熱穩(wěn)定蛋白穩(wěn)定性影響一方面隨著外部鹽溶液濃度的增大，熱穩(wěn)定蛋白的穩(wěn)定性下降，從SDS-PAGE圖譜分析可知，蛋白質(zhì)種類也逐漸減少甚至消失，尤其當(dāng)鹽溶液濃度為3%時，熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)含量及蛋白組成減少最為明顯；另一方面隨著離子價態(tài)的升高，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性也隨著降低，SDS-PAGE圖譜證明蛋白質(zhì)穩(wěn)定性與離子價態(tài)存在聯(lián)系。由此pH與鹽離子強(qiáng)度影響蛋白質(zhì)的存在狀態(tài)，影響蛋白質(zhì)間的相互作用，進(jìn)而影響其穩(wěn)定性。

大麥中的熱穩(wěn)定蛋白涉及啤酒的非生物穩(wěn)定性以及啤酒的冷渾濁［10］，對啤酒的品質(zhì)和風(fēng)味影響很大，本文通過改變pH及離子強(qiáng)度分析了大麥熱穩(wěn)定蛋白的穩(wěn)定性，為啤酒生產(chǎn)有針對性的改進(jìn)提供參考。

［1］郝俊光，陳堅(jiān)，李崎，等.啤酒和啤酒泡沫中蛋白質(zhì)組成的差異性比較［J］.釀酒科技，2006（4）：38-46.

［2］HEJGAARD J，KAERSGAARD P.Purification and properties of major antigenic beer protein of barley origin［J］.Journal of the Institute of Brewing，1983，89（6）：402-410.

［3］EVANS D E，ROBINSON L H，SHEEHAN M C，et al. Application of immunological methods to differentiate between foam-positive and haze-active proteins originating from malt［J］. Journal of the American Society of Brewing Chemists，2003，61：55-62.

［4］KAPP G R，BAMFORTH C W.The foaming properties of proteins isolated from barley［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2002，82：1276-1281.

［5］EVANS D E，SHEEHAN M C.Do not be fobbed off：The substance of beer foam-a review［J］.Journal of American Society of Brewing Chemistry，2002，60：47-57.

［6］丁燕，杜金華.影響啤酒外觀穩(wěn)定性的因素及其控制［J］.食品科學(xué)，2002，23（2）：160-164.

［7］LUDIBINE ROCHEAU，HELENE ROGNIAUX，et al.Probing heat-stable water-soluble proteins from barley to malt and beer［J］.Proteomics，2005，5：2849-2858.

［8］孫俊，張?zhí)煅瑢O麗華，等.大麥發(fā)芽過程中熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)的變化及部分生化特性［J］.大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（3）：223-227.

［9］BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

［10］EVANS D E，ROBINSON L H，SHEEHAN M C，et al. Application of immunological methods to differentiate between foam-positive and haze-active proteins originating from malt［J］. J Am Soc Brew Chem，2003，61：55-62.

Effect of ionic strength and pH on stability of heat-stable protein in the barley

CHEN Xia1，JIANG Xiao-lei1，LI Ming-da1，HAN Dan3，MO Xin-ying1，SHI Wei-chen2，ZHAO Chang-xin1，*
（1.School of Bio&Food Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China；2.Fermentation industry Association of China，Beijing 100833，China）

Heat-stable protein in the barley takes an important role in the non-biological stability and turbidity in the beer.The Bradford method and SDS-PAGE were used to study the stability of heat-stable protein in the barley after changing pH and ionic strength.The results showed that both pH and ionic strength took an important role in the stability of heat-stable protein，the influence of alkaline environment was far bigger than acid environment，ionic strength was inversely correlated with the stability of heat-stable protein.With the ionic valent states increasing，stability of heat-stable protein reduced.The study provided reliable parameters for the study on characteristics of heat-stable protein，and provided references for pertinently improvement in beer production.

barley；heat-stable protein；ionic strength

TS210.1

A

1002-0306（2010）12-0087-04

2009-12-15 *通訊聯(lián)系人

陳霞（1983-），女，碩士研究生，研究方向：釀造大麥中熱穩(wěn)定蛋白。

國家“十一五”國家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2007BAK36B01）；遼寧省教育廳發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目（2004LN-FJ-004）。