徐 凱，石殿瑜，邱 然，趙長新

（1.中糧麥芽（大連）有限公司，遼寧大連116200；2.中糧麥芽（江陰）有限公司，江蘇江陰214434；3.大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，遼寧大連116034）

大麥蛋白組分對糖化麥汁的影響

徐 凱1，石殿瑜2，邱 然1，趙長新3，*

（1.中糧麥芽（大連）有限公司，遼寧大連116200；2.中糧麥芽（江陰）有限公司，江蘇江陰214434；3.大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，遼寧大連116034）

根據(jù)不同蛋白組分溶解特性，以不同溶劑依次提取了大麥中蛋白組分，將各組分蛋白重組到麥芽粉中進(jìn)行糖化。結(jié)果表明，醇溶蛋白是對糖化過程和糖化麥汁質(zhì)量有較大負(fù)面影響的組分，其中非凝膠醇溶蛋白中的一些組分或被一定程度降解得到的多肽是導(dǎo)致麥汁混濁的主要成分；而凝膠醇溶蛋白是導(dǎo)致麥汁分離困難的主要因素。

大麥，蛋白，麥汁，聚丙烯酰胺凝膠電泳

大麥蛋白組成對制麥、糖化、發(fā)酵及成品啤酒的泡沫、風(fēng)味、非生物穩(wěn)定性都會產(chǎn)生很大的影響［1］。大麥總氮這一指標(biāo)已經(jīng)被國內(nèi)生產(chǎn)廠作為選擇啤酒釀造大麥的主要依據(jù)。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，僅靠總氮來衡量大麥的蛋白品質(zhì)明顯不能滿足生產(chǎn)需要。為此，深入了解大麥蛋白的組成對實際制麥和啤酒生產(chǎn)的影響是十分必要的。研究表明大麥中的蛋白質(zhì)對啤酒生產(chǎn)中糖化工藝過程及所得麥汁質(zhì)量的影響都是非常顯著的，它對麥汁的分離過程有很大的影響［2］。另有研究發(fā)現(xiàn)，麥汁的濁度同大麥中的蛋白含量有很大的聯(lián)系，而麥汁濁度對啤酒發(fā)酵過程及成品啤酒的非生物穩(wěn)定性和風(fēng)味穩(wěn)定性都有明顯的影響［3］。因此，本文通過提取大麥各組分蛋白，特別是將大麥醇溶蛋白以乙醇溶液和含有還原劑巰基乙醇的乙醇溶液分步提取，以區(qū)分出非凝膠醇溶蛋白和凝膠醇溶蛋白，然后將各組分蛋白重新添加到麥芽粉中進(jìn)行糖化，以期找出對麥汁糖化過程和麥汁質(zhì)量有負(fù)面影響的蛋白組分，并為進(jìn)一步更加有針對性的研究制麥及啤酒釀造中蛋白質(zhì)的降解提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大麥品種 澳大利亞大麥Hordeum sp.Gairdner；標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白 Sigma；丙烯酰胺、甘氨酸Amresco；SDS-PAGE低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn) Takara；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

EBC麥芽粉碎機(jī) 德國PFFEUIFFER；自動糖化器 德國LB；2100P濁度計 美國HACH；TU1900紫外可見分光光度計 北京普析通用；TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī) 長沙湘儀；JM-250型小型電泳儀 大連捷邁；凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP。

1.2 實驗方法

1.2.1 大麥蛋白組分分離工藝 參考奧斯保式分離工藝［4］，將大麥粉碎，在4℃下用0.5mol/L氯化鈉溶液100mL浸取10g大麥粉1h，離心分離后，殘余物用50mL去離子水洗2次，每次30min，然后再離心。將上述三次上清液混合，用去離子水透析（4℃，48h，截流分子量12～14kDa），然后離心分離，清液即為水溶蛋白，沉淀物為鹽溶蛋白。用鹽溶液提取后的殘留物用100mL的70%酒精溶液進(jìn)一步提取，60℃下提取1h，離心后沉淀用50mL酒精溶液重復(fù)提取兩次，每次30min，合并三次上清液為非凝膠醇溶蛋白。離心后沉淀再用含5%疏基乙醇的70%乙醇溶液提取凝膠性醇溶蛋白，方法同非凝膠性醇溶蛋白。沉淀再以5%氫氧化鈉100mL在室溫下提取兩次，每次1h，離心分離，上清液用水透析（4℃，48h），得到沉淀物即為堿溶蛋白。上述過程中離心操作均在4000r/min進(jìn)行15min。將上述五種組分及最后的殘留物冷凍干燥，用研缽磨碎殘留物，備用。

表2 過濾時間和麥汁中多酚含量

1.2.2 蛋白組分分析 采用Bradford法測定蛋白質(zhì)的含量，以考馬斯亮藍(lán)G-250溶液進(jìn)行顯色、比色，標(biāo)準(zhǔn)曲線用牛血清白蛋白制作，具體操作見參考文獻(xiàn)［5］?？偺窃谒崴夂?，采用文獻(xiàn)［6］方法測定。

1.2.3 重組糖化 在80%麥芽中添加用上述方法制得的蛋白組分，添加量相當(dāng)于20%麥芽所含蛋白量，將不同的重組混合物進(jìn)行糖化（圖1所示）。每組取10.0g樣品置于已知重量的糖化杯中，加入46℃去離子水40mL，在不斷攪拌下于45℃水浴中保溫30min。以1℃/min的速度升溫加熱水浴，在25min內(nèi)升至70℃，此時于杯內(nèi)加入70℃的去離子水20mL，醪液于70℃下保溫1h后，以1℃/min的速度升溫至80℃并保溫10min，在10～15min內(nèi)迅速冷卻至室溫。沖洗攪拌器，加水使內(nèi)容物準(zhǔn)確稱量為90.0g。攪動糖化醪并用中速濾紙過濾，將最初收集的20mL濾液返回重濾，記錄過濾時間，收集濾液于干燥燒杯中。每組制備的糖化麥汁必須在4h內(nèi)測定完畢。

圖1 蛋白組分重組

1.2.4 麥汁分析 根據(jù)EBC方法進(jìn)行分析［7］。

1.2.5 蛋白組分的SDS-PAGE 分別稱取各組分蛋白1mg，溶于2mL加入樣品緩沖液中（50mmol/L Tris-HCl，pH6.8，5%β-巰基乙醇，2%SDS，10%甘油，0.1%溴酚藍(lán)），沸水浴5min，冷卻后供電泳上樣用。

按照 Laemmli的 SDS-PAGE方法［8］，濃縮膠5%，分離膠12%，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，醋酸-甲醇體系脫色。SDS-PAGE電泳圖譜采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白組分分析結(jié)果

表1給出了各組分蛋白的分離收率、含量及總糖的含量。殘留物占總質(zhì)量的91.85%，是最主要的組分，它含有95%以上的淀粉和3.93%的蛋白質(zhì)，在提取過程中造成的損失占麥粒的0.3%，主要是由分子量小于12～14kDa的水溶性化合物組成。將大麥各組分蛋白質(zhì)含量與測得的總蛋白含量10.12%相比較，可看出在提取過程中只損失了0.9%的凱氏氮。通過不同組分的收率及其蛋白含量可以計算出，以本實驗方法提取的大麥蛋白中分別有8.34%清蛋白、6.63%球蛋白、11.18%非凝膠醇溶蛋白、7.78%凝膠醇溶蛋白、21.49%堿溶性谷蛋白和35.69%不溶于堿的谷蛋白。

表1 蛋白組分化學(xué)組成

2.2 麥汁分析結(jié)果

由表2中過濾時間數(shù)據(jù)可看出，對過濾影響較大的組分是凝膠醇溶蛋白、堿溶谷蛋白和提取殘留物，主要原因為凝膠醇溶蛋白和堿溶谷蛋白在糖化過程中可以重新形成二硫鍵，使之聚合為二硫化物聚合體［9］，這些二硫化物聚合體堆積在過濾層上而導(dǎo)致過濾速度降低；提取殘留物也因為增大了過濾層厚度而導(dǎo)致過濾速度降低。

從多酚含量數(shù)據(jù)中可看出，對多酚含量影響最大的組分是提取殘留物，其次是堿溶性組分，而其它幾個組分對多酚含量影響不大，說明堿溶組分中提取出一部分多酚物質(zhì)，而大部分多酚物質(zhì)沒有被溶解出來，留在殘留物中。

2.3 重組糖化對麥汁濁度的影響

如圖2所示，全麥麥汁濁度（20℃）為1.9EBC，對比添加單獨的組分糖化（B～G）得到的麥汁可以看出，麥汁中水溶性組分使?jié)岫认陆?.38EBC；鹽溶性組分、凝膠醇溶性組分和堿溶性組分對混濁影響很?。粴埩粑锝M分使?jié)岫壬仙?.33EBC；非凝膠醇溶性組分對混濁影響最大，使?jié)岫壬仙?.16EBC。把殘留組分與其它組分混合添加進(jìn)行糖化（H～L），發(fā)現(xiàn)與水溶性組分的混合糖化濁度降低了0.25EBC，而與非凝膠醇溶性組分的混合糖化濁度分別比兩組分單獨糖化增加了4.84EBC和2.01EBC，顯示了這兩種組分對混濁的增加有相互增強(qiáng)的作用。通過對比三種組分重組進(jìn)行糖化（M～V），進(jìn)一步說明了水溶性組分對濁度有降低作用，而非凝膠醇溶性組分和殘留物組分有增加濁度的作用，并且這兩個組分的混合物可導(dǎo)致濁度有額外的增高。

2.4 SDS-PAGE電泳分析

由圖3可以看出，大麥種子中水溶清蛋白缺乏高分子量蛋白組分，而富含中、低分子量蛋白亞基，其亞基在分子量10～66kDa間分布。大麥清蛋白由一個相對較小的基因家族所編碼［10］，這部分蛋白主要為酶、酶原、酶抑制劑及被降解的多肽等［11］。鹽溶球蛋白組成的種類與清蛋白大多相似，也均為中、低分子量蛋白亞基，這與Gorg等人研究結(jié)果相符［12］，這部分蛋白主要為結(jié)構(gòu)與代謝蛋白。清蛋白與球蛋白在種子的信息傳遞、能量轉(zhuǎn)化及物質(zhì)代謝中有重要作用，也就是通常所說的組織蛋白［13］。在沒有還原劑的條件下提取的非凝膠醇溶蛋白包括全部的A、B1、B2醇溶蛋白和部分的B3、C醇溶蛋白；而加了還原劑提取的凝膠醇溶蛋白中包括部分B3醇溶蛋白，少量的C醇溶蛋白和全部的D醇溶蛋白。堿溶谷蛋白組分電泳結(jié)果可看出，谷蛋白亞基在分子量20～100kDa間分布，谷蛋白是高分子的大麥貯存蛋白，它是由通過二硫鍵連接的多肽單體組成。大麥醇溶蛋白和谷蛋白也就是通常說的貯藏蛋白，它們在大麥發(fā)育中形成，為種子萌發(fā)及幼苗生長提供氮源。

圖2 麥汁的濁度

圖3 大麥蛋白組分SDS-PAGE電泳圖

3 討論

麥芽的糖化是將淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)降解為小分子物質(zhì)，以供發(fā)酵生產(chǎn)中酵母菌利用的過程?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，麥汁濁度的變化對啤酒發(fā)酵過程有一定的影響，對成品啤酒的非生物穩(wěn)定性和風(fēng)味穩(wěn)定性有明顯的影響。大量研究證明，麥汁中的混濁主要是由蛋白質(zhì)和多酚在氧、光照、振蕩、金屬離子等多種因素的催化下產(chǎn)生了比較穩(wěn)定的共價鍵而形成的［14］。

將大麥蛋白的不同提取物添加到麥芽中進(jìn)行不同的糖化，鹽溶球蛋白、凝膠醇溶蛋白和堿溶谷蛋白對麥汁的混濁影響較小，這是因為球蛋白在糖化過程中基本被降解成短肽和氨基酸，而凝膠醇溶蛋白和堿溶蛋白未被降解部分將形成聚合體被濾出而不存在于麥汁中；水溶清蛋白組分能一定程度地降低麥汁濁度，這是由清蛋白中蛋白酶在發(fā)揮作用，它能水解一部分混濁敏感蛋白從而降低麥汁的濁度；相反，非凝膠醇溶蛋白和提取殘留物分別使?jié)岫仍黾恿?00%和100%以上，并且這兩個組分的混合物可導(dǎo)致糖化麥汁濁度有額外的增高?？疾旆悄z醇溶組分的成分可看出，其中含有近90%的蛋白質(zhì)，再除去含有少量水分外該組分只有少量的糖類等其它物質(zhì)，麥汁中的多酚物質(zhì)主要來自于麥芽，而麥芽中的多酚物質(zhì)主要存在于谷皮中［15］，通過考察添加提取殘留物組分糖化結(jié)果證實了該組分中含有大量的多酚類物質(zhì)。所以，我們認(rèn)為麥汁中的混濁主要是因為非凝膠醇溶蛋白中的一些組分或被一定程度降解得到的多肽與提取殘留物中的多酚發(fā)生聚合反應(yīng)所引起的。這與Chapon［16］和Karl［17］等人的研究結(jié)果是一致的。

一般認(rèn)為，大麥蛋白中的二硫鍵是導(dǎo)致糖化分離困難的原因，在糖化過程中，大部分清蛋白和球蛋白被蛋白酶水解，只有小部分凝膠蛋白的二硫鍵被還原，其蛋白亞基被水解［18］，而大部分含巰基的單體蛋白中巰基被氧化成二硫鍵形成了凝膠蛋白聚合體，在糖化后谷物殘渣中形成一層“無法穿越層”。凝膠醇溶蛋白和堿溶谷蛋白是在提取劑中加入了還原劑巰基乙醇將大麥蛋白中二硫鍵還原后才提取出來的，而麥汁的過濾速度指標(biāo)可看出這兩部分蛋白的添加明顯延長了過濾時間，證明了這兩部分蛋白在糖化過程中可以重新通過二硫鍵形成凝膠蛋白二硫化物聚合體，這些蛋白聚合體堆積在過濾層上而導(dǎo)致過濾速度降低。另一個導(dǎo)致過濾速度降低的組分是提取殘留物，這是因為該組分中的麥皮等殘留物增大了過濾層厚度而導(dǎo)致過濾時間的延長。因為過濾時間指標(biāo)的檢測人為誤差較大，并不十分精確，只能依此指標(biāo)指示出各組分對糖化分離的影響趨勢，而無法定量的對影響程度進(jìn)行準(zhǔn)確地分析。

綜上所述，醇溶蛋白是對糖化過程和糖化麥汁有較大負(fù)面影響的蛋白組分，因此如何調(diào)節(jié)萌發(fā)期內(nèi)大麥種子中蛋白酶活性，使醇溶蛋白在萌發(fā)過程和糖化過程中適當(dāng)?shù)亟到?，將成為種子萌發(fā)機(jī)理研究及制麥科技和遺傳育種的一個重要方面。

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Effect of barley protein components on wort

XU Kai1，SHI Dian-yu2，QIU Ran1，ZHAO Chang-xin3，*
（1.Cofco Malt（Dalian）Co.，Ltd.，Dalian 116200，China；
2.Cofco Malt（Jiangyin）Co.，Ltd.，Jiangyin 214434，China；3.College of Biology&Food Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China）

Barley seed protein fractions，such as albumin，globulin，prolamin and glutenin were successively extracted by using different solvents，and mashed with malt separately.lt was showed that the hordein fractions had negative influence on quality indexes of wort.Some polypeptides that may be hydrolysate of non-gel-forming hordein induced to wort.However，the gel-forming hordein is a factor which leads to filtration difficulty.

barley；protein；wort；SDS-PAGE

TS210.1

A

1002-0306（2010）12-0072-04

2009-11-19 *通訊聯(lián)系人

徐凱（1982-），男，碩士，研究員，研究方向：制麥技術(shù)。

國家科技部“十一五”科技支撐項目（2007BAK36B01）。