張鐵華，張春紅，李盛鈺，陳玉江，鄭 健，楊貞耐，*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，吉林長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062）

發(fā)酵條件對(duì)嗜熱鏈球菌ST1發(fā)酵乳粘度的影響

張鐵華1，2，張春紅2，李盛鈺2，陳玉江2，鄭 健2，楊貞耐1，2，*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，吉林長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062）

對(duì)一株產(chǎn)粘嗜熱鏈球菌ST1的形態(tài)進(jìn)行了觀察，探討了pH、溫度、不同碳源和乳清濃縮蛋白（WPC）對(duì)嗜熱鏈球菌ST1發(fā)酵脫脂乳粘度、酸度的影響。該菌株經(jīng)活化，在全脂乳固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后、采用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察到菌體呈球形或卵形，鏈狀分布，菌體表面沒(méi)有莢膜。用ST1發(fā)酵10%脫脂乳，獲得了不同發(fā)酵時(shí)間下表觀粘度和滴定酸度的變化情況，優(yōu)化出嗜熱鏈球菌ST1發(fā)酵脫脂乳產(chǎn)粘的條件為：pH 6.5，溫度42℃，添加2%（w/v）蔗糖或0.5%（w/v）WPC392。

嗜熱鏈球菌ST1，發(fā)酵脫脂乳，粘度，滴定酸度，發(fā)酵條件

脫脂乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后粘度會(huì)發(fā)生一定的變化，不同菌種凝乳的粘度不同，其中產(chǎn)粘較顯著者稱(chēng)之為粘性菌株。產(chǎn)粘乳酸菌在發(fā)酵乳中的應(yīng)用在法國(guó)和荷蘭倍受重視，因?yàn)檫@些國(guó)家禁止在非果味酸奶中添加植物性或者動(dòng)物性穩(wěn)定劑。許多資料報(bào)道，乳酸菌產(chǎn)生的粘性物質(zhì)成分復(fù)雜，通常含有多糖類(lèi)化合物，有的粘性物質(zhì)具有一定的抗癌性，有些粘性菌株具有顯著的降膽固醇作用［1］。粘度與攪拌型酸奶的感官質(zhì)量密切相關(guān)，攪拌型酸奶在貨架期容易產(chǎn)生乳清析出現(xiàn)象，風(fēng)味變差，同時(shí)降低了粘度。乳酸菌產(chǎn)粘特性受諸多因素的影響，如發(fā)酵溫度、pH、培養(yǎng)基組成等，可以通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件的方式來(lái)提高脫脂酸奶的粘稠度，從而解決產(chǎn)品感官質(zhì)量問(wèn)題。國(guó)外很多研究者指出乳酸菌能夠產(chǎn)生高分子量的多糖，從而提高發(fā)酵產(chǎn)品的粘度［2］。用產(chǎn)粘性多糖的德式保加利亞乳桿菌培養(yǎng)時(shí)，酸乳的粘度明顯升高［3］。另外，粘性嗜熱鏈球菌LY03產(chǎn)生大量的高分子量多糖，能顯著提高發(fā)酵乳的粘度［4］。本研究對(duì)一株產(chǎn)粘的嗜熱鏈球菌ST1在發(fā)酵凝乳過(guò)程中酸乳粘度和滴定酸度的變化進(jìn)行了量化測(cè)評(píng)，優(yōu)化了影響表觀粘度變化的發(fā)酵條件，為新型低脂酸乳保健產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔗糖、乳糖、葡萄糖、半乳糖和果糖 均為食用級(jí)；乳清濃縮蛋白（WPC392） 購(gòu)買(mǎi)于 ADF（American Dariyfoods）公司；進(jìn)口脫脂奶粉 新西蘭；伊利全脂奶粉 市售；嗜熱鏈球菌ST1 來(lái)源于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，菌種儲(chǔ)存在-80℃條件下，用10%（w/v）脫脂乳添加30%（v/v）的甘油作為冷凍保護(hù)劑，嗜熱鏈球菌在42℃下培養(yǎng)18h，活化三次后，用于后續(xù)的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)；全脂乳固體培養(yǎng)基 10%（w/v）全脂乳、1.1%瓊脂和0.01%剛果紅，將瓊脂用蒸餾水完全溶解，在微波爐內(nèi)加熱1min后倒入加有剛果紅的全脂乳中，并快速攪拌均勻，然后將全脂乳瓊脂培養(yǎng)液115℃滅菌15min后進(jìn)行倒板；脫脂乳液體培養(yǎng)基 10%（w/v）脫脂乳，在115℃滅菌15min后作為發(fā)酵培養(yǎng)基，起始 pH用0.1mol/L NaOH和1mol/L乙酸進(jìn)行調(diào)節(jié)，堿和酸均用0.22μm的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾后加入已滅菌的脫脂乳中。

Brookfield DV-Ⅲ粘度儀 Brookfield Engineering Labs Inc.，Stoughton，MA；HY-5A型回旋式振蕩器江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒公司；正置熒光顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 嗜熱鏈球菌ST1的形態(tài)特征觀察 在全脂乳固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)ST1 8h后，在剛果紅形成的淺紅色背景下獲得肉眼可見(jiàn)的乳白色菌落。挑取一環(huán)菌落放在載玻片上，加一滴墨汁，用蓋玻片輕輕平鋪成平面以便觀察，然后放在無(wú)菌操作臺(tái)上用風(fēng)吹干，加一滴結(jié)晶紫進(jìn)行染色30s～1min并風(fēng)干后用蒸餾水輕輕沖洗掉結(jié)晶紫，然后在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.2 發(fā)酵乳表觀粘度的測(cè)定 將酸奶樣品浸沒(méi)于粘度計(jì)轉(zhuǎn)子刻度以上，放入溫度探棒，待溫度穩(wěn)定在20℃之后，轉(zhuǎn)速為100r/min，用3號(hào)轉(zhuǎn)子測(cè)定1min后的表觀粘度。

1.2.3 發(fā)酵乳酸度的測(cè)定 吸取10mL發(fā)酵乳，置于100mL的三角瓶中，加入蒸餾水20mL，加入1滴0.5%的酚酞乙醇溶液，小心搖勻，用0.1mol/L的氫氧化鈉溶液滴定到微紅色，在1min內(nèi)不消失為測(cè)定終點(diǎn)（終點(diǎn)用0.005%堿性品紅溶液做對(duì)照）。具體計(jì)算：

式中：VNaOH為消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V1為空白溶液消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；CNaOH為標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L。

1.2.4 取樣 用嗜熱鏈球菌ST1發(fā)酵10%（w/v）脫脂乳48h，接種量1%。從0時(shí)刻起開(kāi)始收集樣品，以后每隔16h取樣，測(cè)定表觀粘度和滴定酸度。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法 本研究采用兩次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)；采用Sigma plot 10.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 嗜熱鏈球菌ST1的形態(tài)特征

在正置熒光顯微鏡下嗜熱鏈球菌ST1的個(gè)體形態(tài)見(jiàn)圖1，菌體呈球形或卵形，成鏈狀排列，菌體表面沒(méi)有莢膜。

圖1 嗜熱鏈球菌ST1的個(gè)體形態(tài)特征

2.2 發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵乳粘度、酸度的影響

2.2.1 pH對(duì)發(fā)酵乳粘度、酸度的影響 在37℃不同初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5和7.0）條件下用ST1發(fā)酵脫脂乳，結(jié)果如圖2，可以看出，在相對(duì)較低的pH（5.0、5.5、6.0）條件下，菌體不能充分利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)滿足自身的生長(zhǎng)，生成多糖和分解蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的能力較低［5］，使得發(fā)酵乳的粘度相對(duì)較低，對(duì)應(yīng)的最大粘度值在發(fā)酵32h或48h后獲得，分別為128.4、198.0、190.8cps。在pH6.5條件下發(fā)酵至32h，菌體生長(zhǎng)情況良好，發(fā)酵乳的粘度和酸度均呈現(xiàn)直線增加趨勢(shì)，產(chǎn)粘和產(chǎn)酸情況很好，最大值分別為369.5cps（32h）和86.9°T（48h）。在pH7.0條件下，菌體的產(chǎn)粘情況比pH6.5條件下稍差些，但優(yōu)于較低pH（5.0、5.5、6.0）條件下的產(chǎn)粘情況。根據(jù)上述結(jié)果，確定pH6.5為嗜熱鏈球菌ST1發(fā)酵脫脂乳的最佳初始pH，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中。

圖2 不同pH對(duì)發(fā)酵脫脂乳表觀粘度（a）和滴定酸度（b）的影響

2.2.2 溫度對(duì)發(fā)酵乳粘度、酸度的影響 在pH6.5不同溫度（30、37、42℃）條件下用ST1發(fā)酵脫脂乳，從圖3可以看出，在發(fā)酵過(guò)程中，30℃時(shí)發(fā)酵乳在發(fā)酵后期的滴定酸度高于37℃和42℃時(shí)的酸度，并在發(fā)酵至32h獲得了最大值134.1°T，而37℃和42℃發(fā)酵過(guò)程中得到的滴定酸度差異不大。有關(guān)粘度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株在低于其適宜生長(zhǎng)溫度時(shí)產(chǎn)粘較低，隨著溫度的升高粘度呈上升趨勢(shì)。30℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)粘度逐漸增加，在發(fā)酵至48h獲得最大粘度值（173.5cps）；37℃時(shí)發(fā)酵至32h獲得了最大的粘度值（191.2cps）。42℃發(fā)酵產(chǎn)生的最大粘度值（259.6cps）大于30℃和37℃的最大粘度值，并且在發(fā)酵16h后獲得。上述結(jié)果表明酸度與粘度呈一定的負(fù)相關(guān)［6］，酸度越高，酸奶的粘度越低，可能是酸度過(guò)大破壞了發(fā)酵乳已形成的膠體結(jié)構(gòu)，使乳清分離，從而影響酸奶的粘度，也可能是高酸度環(huán)境對(duì)胞外多糖保持其質(zhì)構(gòu)有影響。同時(shí)，ST1在較高溫度下發(fā)酵更有利于發(fā)酵奶在最短的時(shí)間內(nèi)提高粘度；而 Lactoccus lactis subsp cremoris LC 320在20～35℃范圍內(nèi)其粘度呈較高的水平，在35℃時(shí)有所下降［7］。有關(guān)乳酸菌產(chǎn)粘特性受溫度的影響作用在國(guó)外已有許多報(bào)道，Garcia-Garlbay等的研究報(bào) 道： Laccobacillus delbrueckll ssp bulgaricus NCFB2772在較高的溫度時(shí)表現(xiàn)出優(yōu)良的產(chǎn)粘特性［8］，Grobben等對(duì)該菌株的產(chǎn)粘特性的研究表明：在42℃培養(yǎng)溫度下，NCFB2772可以產(chǎn)生較大粘性，但在高于45℃時(shí)產(chǎn)粘急劇下降，甚至失去了產(chǎn)粘特性［9］。

圖3 不同溫度對(duì)發(fā)酵脫脂乳表觀粘度和滴定酸度的影響

2.3 碳源對(duì)發(fā)酵乳粘度、酸度的影響

在pH6.5，42℃條件下用ST1發(fā)酵加入2%（w/v）不同碳源（蔗糖、乳糖、葡萄糖、半乳糖和果糖）的脫脂乳，用空白脫脂乳作對(duì)照。從圖4可以看出，在脫脂乳中添加不同的碳源，發(fā)酵乳粘度值有不同的變化。相對(duì)于空白脫脂乳發(fā)酵至16h獲得最大粘度值（259.6cps），添加碳源后發(fā)酵脫脂乳獲得最大值的時(shí)間延長(zhǎng)，在發(fā)酵至32h獲得。碳源對(duì)粘度的影響效果為果糖（600.0cps）＞乳糖（479.0cps）＞蔗糖（298.0cps）＞ 葡 萄 糖（271.0cps）＞ 半 乳 糖（195.3cps）。有關(guān)酸度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與加入其他碳源相比，加入半乳糖的發(fā)酵乳中滴定酸度相對(duì)較低。發(fā)酵至48h，果糖（98.1°T）＞乳糖（91.0°T）＞蔗糖（83.4°T）＞葡萄糖（76.5°T）＞半乳糖（65.0°T），均低于空白樣發(fā)酵至48h得到的滴定酸度（104.5°T）。碳源的添加使得菌體的生長(zhǎng)情況更好，分解蛋白質(zhì)和合成粘性物質(zhì)的能力得到提高，ST1利用果糖、乳糖和蔗糖的效果較好，而利用半乳糖的效果較差。并不是所有的嗜熱鏈球菌有能力利用蔗糖，從粘度和工業(yè)大量生產(chǎn)的低成本要求考慮，嗜熱鏈球菌ST1利用蔗糖效果較好，可以應(yīng)用于甜制發(fā)酵乳品中。

圖4 不同碳源對(duì)發(fā)酵脫脂乳表觀粘度（a）和滴定酸度（b）的影響

2.4 氮源對(duì)發(fā)酵乳粘度、酸度的影響

據(jù)報(bào)道，應(yīng)用乳清濃縮蛋白可以為酸奶提供獨(dú)特的功能特性，可改善酸奶的風(fēng)味、硬度和粘度，降低酸味感，防止乳清析出［10-12］。在pH6.5，42℃下用ST1發(fā)酵加入0.5%（w/v）WPC392的脫脂乳，從圖5可以看出，在發(fā)酵過(guò)程中，滴定酸度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，發(fā)酵初期增加速度較快，發(fā)酵至16h趨于穩(wěn)定，發(fā)酵48h后的滴定酸度分別為93.0°T（空白脫脂乳）和79.4°T（加WPC392的脫脂乳）。發(fā)酵至16h，對(duì)照組發(fā)酵乳的粘度達(dá)到最大值259.6cps；發(fā)酵至32h，添加WPC392的發(fā)酵乳粘度達(dá)到最大值270.3cps。牛龍江等人的研究指出，蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的緩沖能力，酸奶貯藏過(guò)程中，乳清蛋白的緩沖作用能防止乳酸過(guò)多引起的pH急劇下降，從而有利于產(chǎn)品中保持較高的乳酸活菌菌數(shù)，并延緩了酸乳因酸度降低而引起的品質(zhì)變差［13］。酸奶中的乳酸菌進(jìn)入衰亡期后還有部分菌有一定的活力，能夠分解蛋白質(zhì)，使酸奶的質(zhì)構(gòu)受到破壞，從而引起粘度下降和滴定酸度的增加。

圖5 WPC392對(duì)發(fā)酵脫脂乳表觀粘度和滴定酸度的影響

3 結(jié)論

3.1 本研究采用的添加有剛果紅的全脂乳固體培養(yǎng)基，首次應(yīng)用在嗜熱鏈球菌菌落分離中，在其他文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道；在淺紅色背景下，培養(yǎng)ST1 8h后可以獲得清晰的乳白色菌落；菌體經(jīng)結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察呈球形或卵形，成鏈狀排列，菌體表面沒(méi)有莢膜。

3.2 嗜熱鏈球菌ST1發(fā)酵脫脂乳產(chǎn)粘適宜條件：pH 6.5，溫度42℃，添加2%（w/v）蔗糖或0.5%（w/v）WPC392。嗜熱鏈球菌ST1利用蔗糖效果較好，可以應(yīng)用于甜制發(fā)酵乳品中。

［1］Hajime N，et al.Cholesterol-lowing Activity of Ropy Fermented milk［J］.Journal of Food Science，1992，52（6）：1327-1329.

［2］Guzel-Seydim，etal.Influencesofexopolysaccharide producing cultures on the quality of plain set type yogurt［J］.Food Control，2005，16：205-209.

［3］Petry S，et al.Comparison of the thickening properties of four Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus strains and physicochemical characterization of their exopolysaccharides［J］. FEMS Microbiology Letter，2003，221：285-291.

［4］DeVuyst L，et al.Exopolysaccharide-producing Streptococcus thermophilus strains as functionalstarter cultures in the production of fermented milks［J］.International Dairy Journal，2003，13：707-717.

［5］Cheirrsilp B，et al.Modeling and optimization of environmental conditions for kefiran production by Lactobacillus kefiranofaciens［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2001，57：639-646.

［6］李勇，董翠芳，歐國(guó)兵.攪拌型酸奶流變學(xué)特性及粘彈性的分析與討論［J］.乳品加工，2009（1）：46-50.

［7］ Valerie M，etal.Analysis and production oftwo exopolysaccharides from lactoccus lactis subsp cremoris LC320［J］.Dairy Res，1995，52：621-628.

［8］Garcia-Garibay M，et al.Polymer production by Laccobacillus delbrueckll ssp bulgaricus［J］.Appl Bacteriol，1995，79：103-107.

［9］Grobben G J，et al.Production of extracellular polysaccharides by lactobacillus bulgaricus NCFB 2772 grown in a chemically defined medium［J］.Appl，Bacterial，1995，79：103-107.

［10］張旭輝，龍芳羽，孫建，等.乳清蛋白的功能特性及其在酸奶中的應(yīng)用［J］.中國(guó)奶牛，2006（6）：46-48.

［11］韓婷，蔡?hào)|聯(lián).乳清蛋白的功能特性及其在酸奶中的應(yīng)用［J］.腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，2005，12（4）：243-246.

［12］De Wit J N.Nutritional and Functional Characteristics of Whey Proteins in Food Products［J］.Journal of Dairy Science，1998，81：597-608.

［13］牛龍江，楊金海，謝明.淺談乳清蛋白及低聚糖在酸牛奶中的可利用性［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2005，33（6）：54-56.

Effect of cultural conditions on the viscosity of fermented milk by Streptococcus thermophilus ST1

ZHANG Tie-hua1，2，ZHANG Chun-hong2，LI Sheng-yu1，CHEN Yu-jiang2，ZHENG Jian2，YANG Zhen-nai1，2，*
（1.Center of Agro-food Technology，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，China；2.College of Light Industry and Economics&Management，Jilin University，Changchun 130062，China）

The morphologic characteristics of a slime-producing strain，Streptococcus thermophilus ST1 were studied.By crystal violet staining，the strain grown on a full-fat milk solid medium was observed by microscopy to be globular or oval without capsules on the bacterial surface，and the bacteria cells were presented in chains.The effects of pH，temperature，supplementation with carbon sources and whey protein concentrate（WPC）on the viscosity of fermented skim milk by S.thermophilus ST1 were studied when the strain was grown in 10% reconstituted skim milk.According to the results of the apparent viscosity and titration acidity of the fermented samples，the optimized cultural conditions for slime production by S.thermophilus ST1 were pH 6.5，temperature 42℃，2%（w/v）sucrose or 0.5%（w/v）WPC392.

Streptococcus thermophilus ST1；fermented skim milk；viscosity；titration acidity；fermentation conditions

TS201.3

A

1002-0306（2010）12-0206-04

2010-01-08 *通訊聯(lián)系人

張鐵華（1970-），男，博士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品精深加工。

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金資助（nycytx-0502）；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20090225）。