葛林立，董 英

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

泡菜中乳酸菌的分離鑒定及模擬環(huán)境脅迫抗性的研究

葛林立，董 英

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

從市售泡菜中分離到7株乳酸菌，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rRNA基因鑒定?；谏砩匦院?6S rRNA基因序列的同源性比較，以及系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定7株菌均為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。并進(jìn)一步對(duì)所分離菌株進(jìn)行低pH和高膽鹽濃度條件下存活能力測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，S-2、D-1、D-3在低pH和高膽鹽濃度條件下存活率為100%～135%，在pH1.5的培養(yǎng)基中4h后活菌數(shù)分別為8.4×108、8.3×108、8.1×108cfu/mL，在0.3%膽鹽條件下4h后活菌數(shù)分別為8.5×108、8.9×108、8.4×108cfu/mL。

乳酸菌，分離，鑒定，16S rRNA基因序列，抗性

泡菜（Pickles）是以蔬菜為原料，利用食鹽的滲透作用，經(jīng)乳酸菌為主的微生物發(fā)酵制成的具有特定風(fēng)味的發(fā)酵蔬菜制品，富含大量的活體乳酸菌［1-2］。現(xiàn)代微生物學(xué)研究表明，泡菜中的乳酸菌對(duì)人體具有保健功能，是微生態(tài)類益生菌中的主要群體［3］，在發(fā)酵成熟的泡菜中植物乳桿菌是優(yōu)勢(shì)菌群［4］。作為一種被公認(rèn)的益生菌，人們也對(duì)乳酸菌的功能性作用進(jìn)行了大量研究，并獲得一些具有特定功能的乳酸菌菌株用于工業(yè)化生產(chǎn)。據(jù)報(bào)道，泡菜汁中富含大量的植物乳桿菌，活菌數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國(guó)內(nèi)外若干種含有乳酸菌的藥物和口服液等商品，可成為具有我國(guó)傳統(tǒng)特色、廉價(jià)、高效的天然微生態(tài)調(diào)節(jié)劑［5］。益生菌在人體體內(nèi)發(fā)揮作用，首先要有足夠量的活體菌到達(dá)小腸［4］，這就要求益生菌對(duì)酸和膽鹽有較強(qiáng)的抵御能力，對(duì)體內(nèi)環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，即對(duì)環(huán)境脅迫有較強(qiáng)的抗性。Maus和Ingham用低pH處理處于生長(zhǎng)穩(wěn)定初期的乳雙歧桿菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，乳雙歧桿菌耐酸能力大大提高［6］。本研究從4種市售散裝泡菜中分離到7株植物乳桿菌，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化初步鑒定，然后采用16S rRNA基因序列分析方法在分子生物學(xué)水平上對(duì)所分離菌株進(jìn)行鑒定。以MRS為培養(yǎng)基，模擬正常人體胃液低pH（正常人體胃液pH1.5～4.5）和十二指腸高膽汁鹽（正常人體小腸中濃度為0.03%～0.3%）的環(huán)境，以本實(shí)驗(yàn)室保存的一株植物乳桿菌為參照，對(duì)比研究7株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的抗脅迫能力，選育出在低pH和高膽鹽濃度條件下具有強(qiáng)存活能力的菌株，為功能性泡菜開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

散裝泡菜 市售，共四種；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） 本實(shí)驗(yàn)室保存，作為參照；分離培養(yǎng)基 固體MRS培養(yǎng)基、液體MRS培養(yǎng)基［7］。

3730型全自動(dòng)測(cè)序儀 美國(guó)ABI公司；PTC-200型DNA擴(kuò)增儀 美國(guó)MJ research INS公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)伯樂公司；電泳儀、電泳槽 南京新科技生物技術(shù)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離純化 取1mL泡菜汁用生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取合適的稀釋梯度，采用傾注法用含2%CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基傾倒平板，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)48h后。挑取溶鈣圈較大的菌落，在MRS固體培養(yǎng)基上劃線分離純化3次，最后選擇單菌落。凡是革蘭氏陽性，過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陰性的初步確定為乳酸菌［8］。革蘭氏染色，鏡檢，保留革蘭氏陽性、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陰性、單個(gè)成對(duì)或鏈狀排列的短或長(zhǎng)桿菌，確認(rèn)純種后4℃斜面保存，供下一步鑒定用。

1.2.2 生理生化特性測(cè)定［7］對(duì)分離的菌株分別進(jìn)行明膠液化實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、H2S實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)、碳水化合物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 16S rRNA序列擴(kuò)增鑒定

1.2.3.1 引物16S rRNA序列擴(kuò)增鑒定 正向引物27F（5′-AgAgTTTgATCCTggCTCAg-3′）；反向引物1541R（5′-AAggAggTgATCCAgCCgCA-3′）；由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3.2 模板DNA的制備 挑取半環(huán)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期的菌落加入到200μL雙蒸水中，混合均勻。

1.2.3.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 雙蒸水22μL，2×PCR mix 25μL，27F 1μL，1541R 1μL，模板DNA 1μL。

1.2.3.4 PCR反應(yīng)條件 95℃預(yù)變性5min，95℃變性1min，55℃復(fù)性1min，72℃延長(zhǎng)1.5min，循環(huán)30次，72℃延長(zhǎng)10min。

1.2.3.5 PCR產(chǎn)物的檢測(cè) 取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與一定比例的上樣緩沖液混合后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（1×TAE電泳緩沖液，80V電泳50min），EB（0.5μL/mL）染色后在凝膠成像系統(tǒng)紫外光透射觀察結(jié)果、拍攝電泳圖，PCR產(chǎn)物為約1.5kb大小的電泳條帶，送專業(yè)測(cè)序公司測(cè)序。

1.2.4 菌懸液的制備 將各供試菌株在MRS液體培養(yǎng)基中活化2次，轉(zhuǎn)接到MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)18h后，取其發(fā)酵液在室溫下4000r/min離心15min，用滅菌生理鹽水洗滌2次，再用液體MRS培養(yǎng)基調(diào)菌懸液濃度約為8.0×109cfu/mL。菌懸液置于4℃冰箱冷藏備用。

1.2.5 低pH條件下菌株存活能力測(cè)試［4，6，9-10］將制備好的菌懸液以10%接種量分別接種在 pH1.5、pH3.0、pH4.5的MRS液體培養(yǎng)基中，最終制成濃度約為108cfu/mL菌懸液，37℃培養(yǎng)4h，并采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定各菌株0h和4h的活菌數(shù)，設(shè)三個(gè)平行。通過活菌數(shù)的改變表示供試菌株不同pH條件下的存活能力。

1.2.6 高膽鹽濃度條件下菌株存活能力測(cè)試［4，6，9-10］將制備好的菌懸液以10%接種量分別接種在牛膽鹽含量為0.1%、0.2%、0.3%的MRS液體培養(yǎng)基中，最終制成濃度約為108cfu/mL菌懸液，37℃培養(yǎng)4h，并采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定各菌株0h和4h的活菌數(shù)，設(shè)三個(gè)平行。通過活菌數(shù)的改變表示供試菌株不同膽鹽濃度條件下的存活能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離、純化

對(duì)4種樣品進(jìn)行系列稀釋后在MRS培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分離純化，共分離到7株乳酸菌，經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢，確定這7株菌均為革蘭氏陽性，過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陰性，單個(gè)、成對(duì)或鏈狀排列的短或長(zhǎng)桿狀菌株，初步確定為乳酸菌。這7株菌分別編號(hào)為：S-1、S-2、S-3、D-1、D-2、D-3、D-4。

2.2 生理生化特性測(cè)定

所分離的7株菌明膠液化實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、H2S實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)均為陰性。初步確定分離的7株菌均為乳桿菌［8］。對(duì)分離的7株菌進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，其中，S-1、S-2、S-3、D-3、D-4均能發(fā)酵果糖、苦杏仁苷、葡萄糖、葡萄糖酸鈣、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖和木糖；D-1除不能發(fā)酵木糖外，可以發(fā)酵其他9種糖；D-2除發(fā)酵木糖弱陽性外可以發(fā)酵其他糖。通過糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)7株菌初步鑒定為植物乳桿菌。

2.3 菌株16S rRNA基因序列

供試菌株16S rRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖見圖1。圖1中從左到右依次是：Mark、S-1、S-2、S-3、D-1、D-2、D-3、D-4、Lp，其中Lp為參比菌株。結(jié)果表明，所分離菌株的16S rRNA基因序列與參比菌株的16S rRNA基因序列大小類似，約為1.5kb左右。

圖1 16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜

2.4 菌株基于16S rRNA基因序列的分子生物學(xué)鑒定

將測(cè)序后所得菌株的部分16S rRNA基因序列輸入到NCBI基因文庫中，使用BLASTN在GenBank +EMBL+DDBJ+PDB基因庫中進(jìn)行同源性搜索比較。依據(jù)同源性比較結(jié)果，在 LPSN（www.bacterio.cict.fr）網(wǎng)站檢索同源性較高的菌株，選擇同源性在98%以上的菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，建樹方法采用鄰近歸并法（Neighbor Joining），應(yīng)用Bioedit和MEGA4軟件進(jìn)行多重比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。

根據(jù)同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育樹，可以看出，分離到 的 7 株 菌 與 Lactobacillus plantarum subsp argentoratensis的親緣關(guān)系最近，可以確定7株菌均為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），該結(jié)果與前面的生理生化鑒定結(jié)果一致。

表1 不同pH條件下菌株存活能力

表2 不同膽鹽濃度條件下菌株存活能力

圖2 基于16S rRNA序列同源性的7株菌系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 低pH條件下菌株存活能力

正常人體胃液pH在1.5～4.5之間，通常pH在3.0左右，食物在胃中的停留時(shí)間一般為1.5h［11］。因此，選擇pH分別為1.5、3.0、4.5的MRS為培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4h，不同pH條件下菌株存活能力測(cè)試結(jié)果見表1。

在pH為1.5的MRS培養(yǎng)基中，7株菌的存活率在40%～102%之間，其中：Lp、S-1、S-2、D-1、D-3存活率都在100%以上；在pH為3.0的MRS培養(yǎng)基中，參照菌株存活率為109%，活菌數(shù)達(dá)到9.0×108cfu/mL，S-3存活率為58%，死亡率接近50%，其他菌株存活率均超過100%；在pH為4.5的MRS培養(yǎng)基中，所有菌株活菌數(shù)均有所增加，D-3存活率為135%，活菌數(shù)為10.9×108cfu/mL。通過比較確定S-1、S-2、D-1、D-3對(duì)酸具有較強(qiáng)的抵御能力，即對(duì)低pH具有較強(qiáng)的抗性。

2.6 高膽鹽濃度條件下菌株存活能力

人體小腸中膽鹽含量在0.03%～0.3%之間波動(dòng)，選擇牛膽鹽含量分別為0.1%、0.2%、0.3%的MRS為培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4h，所分離菌株在不同膽鹽濃度條件下的存活能力見表2。

在膽鹽含量為0.1%的培養(yǎng)基中，8株菌存活率都在100%以上，其中：D-1比參照菌株具有更強(qiáng)的存活能力，存活率為109%，活菌數(shù)為8.9×108cfu/mL，可能是由于培養(yǎng)基中的膽鹽含量低不足以抑制乳酸菌的生長(zhǎng)；在膽鹽含量為0.2%的培養(yǎng)基中，除D-4存活率下降外，其他菌株存活率超過100%，S-1、S-2、D-1、D-2、D-3存活率分別為101%、102%、107%、101%、102%，高于參照菌株。在膽鹽含量為0.3%的培養(yǎng)基中，S-2、D-1、D-3存活率分別為101%、106%、104%，D-1活菌數(shù)為8.7×108cfu/mL，參照菌株Lp存活率僅為85%，D-4存活率最低為53%。從表2我們可以看出，S-2、D-1、D-3對(duì)高濃度膽鹽具有較強(qiáng)的抗性，D-1存活能力最強(qiáng)，隨著膽鹽濃度的增加，D-1存活率沒有明顯的降低，存活率均在100%以上。

3 結(jié)論

從市售散裝泡菜中分離到7株乳酸菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定和16S rRNA基因序列分析，鑒定其為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；從中篩選出對(duì)低pH和高膽鹽濃度均具有較強(qiáng)抗性的菌株S-2、D-1、D-3，其在低pH和高膽鹽濃度條件下存活率為100%～135%，具有良好的益生菌開發(fā)潛力。

［1］張剛.乳酸細(xì)菌—基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：242-245.

［2］Jae-Hun Kim，Jin-Gyu Park，Ju-Woon Lee，et al.The combined effects of N2-packaging，heating and gamma irradiation on the shelf-stability of Kimchi，Korean fermented vegetable［J］. Food Control，2008，19：56-61.

［3］Benjamas Jonganurakkun，Qi Wang，Shan Hua Xu，et al. Pediococcus pentosaceus NB-17 for Probiotic Use［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2008，106（1）：69-73.

［4］Julius Maina Mathara，Ulrich Schillinger，Phillip M Kutima，et al.Functional Properties of Lactobacillus plantarum Strains Isolated from Maasai Traditional Fermented Milk Products in Kenya［J］.Int J Food Microbiol，2008，56）：315-321.

［5］王艷梅，馬儷珍.泡菜汁中乳酸菌的分離與初步鑒定［J］.天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，14（3）：5-8.

［6］郭興華.益生乳酸細(xì)菌---分子生物學(xué)及生物技術(shù)［M］.北京：科學(xué)出版社，2008：327-331.

［5］凌代文，東秀珠.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1999：85-88，118.

［8］王亞峰，霍貴成，劉麗波.開菲爾粒中乳酸菌的分離與鑒定［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2004，32（9）：17-19.

［9］周雨霞.內(nèi)蒙古牧區(qū)傳統(tǒng)乳制品中乳桿菌生物學(xué)特性及其益生作用的研究［D］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，2006：42.

［10］B Hyronimus，C Le Marrec，A Hadj Sassi，et al.Acid and bile tolerance of spore-forming lactic acid bacteria［J］. International Journal of Food Microbiology，2000，61：193-197.

［11］Aysun Cebeci，Candan G urakan.Properties of potential probiotic Lactobacillus plantarum strains［J］.Food Microbiology，2003，20：511-518.

Study on the isolation，identification and antagonistic property of lactic bacteria from pickle

GE Lin-li，DONG Ying
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

7 strains of lactic acid bacteria were isolated and identified from many sorts of pickle.Their physiological，biochemical properties and 16S rRNA gene sequence were characterized.Based on their physiological and biochemical properties，homology and phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequence，7strains were Lactobacillus plantarum.These strains were further characterized for the presence of functional traits useful for probiotic applications，such as resistance to acid and resistance to bile salts.S-2，D-1 and D-3 showed survival rates ranged from 100%to 135%，and expressed acid tolerance at pH 1.5 after 4h incubation and the living bacteria number reached 8.4×108，8.3×108and 8.1×108cfu/mL，respectively.Similarly，these bacteria expressed tolerance to bile salts at the concentration of 0.3%，after 4h incubation and the living bacteria number reached 8.5× 108，8.9×108，8.4×108cfu/mL.

lactic acid bacteria；isolation；identification；16S rRNA gene sequence；antagonistic property

TS255.54

A

1002-0306（2010）12-0189-04

2009-12-17

葛林立（1983-），男，在讀碩士研究生，從事乳酸菌直投式發(fā)酵劑的研究與開發(fā)。

江蘇省科技計(jì)劃項(xiàng)目（BG2007339）。