朱建勇

（重慶文理學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶402168）

金針菇F19產(chǎn)多糖液體發(fā)酵條件優(yōu)化

朱建勇

（重慶文理學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶402168）

為研究金針菇液體發(fā)酵獲得多糖的最佳非營(yíng)養(yǎng)因子，以金針菇雜交菌種F19為試材，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)研究了非營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)金針菇液體發(fā)酵多糖產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，金針菇F19液體發(fā)酵多糖產(chǎn)量收率最好的非營(yíng)養(yǎng)因子發(fā)酵條件為：菌齡48h、接種量10%、起始pH7.5、發(fā)酵溫度26℃、搖床轉(zhuǎn)速130r/min、發(fā)酵時(shí)間7.5d，多糖得率為1.86mg/mL。

金針菇，非營(yíng)養(yǎng)因子，液體發(fā)酵，多糖

金針菇［Flammulina velutipes（Fr.）Sing.］又名冬菇、樸菇、構(gòu)菌、青杠菌、毛柄金錢菌，隸屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口蘑科，金錢菌屬［1］。金針菇多糖有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性［2-7］，對(duì)化療藥環(huán)磷酰胺也有增效減毒作用［8］，還具有抗疲勞、降血漿膽固醇、延長(zhǎng)壽命、抗凝血、抗艾滋病病毒（HIV）、消除自由基和抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用等功效［9-12］。本研究采用了單因素和正交組合實(shí)驗(yàn)研究了菌齡、接種量、起始pH、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間6個(gè)因素對(duì)金針菇F19液體發(fā)酵多糖產(chǎn)量的影響，旨在探索金針菇多糖最大收率時(shí)的非營(yíng)養(yǎng)因子發(fā)酵最優(yōu)條件，為金針菇多糖產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雜交金針菇菌種F19 由四川成都食用菌研究所提供；活化培養(yǎng)基 馬鈴薯200g（去皮煮汁）、葡萄糖（AR）20g、瓊脂18g、KH2PO4（AR）1.5g、MgSO4（AR）1.0g，pH自然，配制成1000mL；種子培養(yǎng)基活化培養(yǎng)基去瓊脂；液體發(fā)酵培養(yǎng)基 馬鈴薯200g（去皮煮汁）、葡萄糖10g、可溶性淀粉30g、玉米粉30g、KCl 1.0g、VB2100mg，配制成1000mL；蒽酮、95%乙醇、丙酮、乙醚 分析純；濃硫酸、濃鹽酸、氫氧化鈉 化學(xué)純。

1.2 金針菇液體發(fā)酵培養(yǎng)

在250mL三角瓶中裝入100mL發(fā)酵培養(yǎng)基，用八層紗布封口，高溫滅菌30min，冷卻后，在無(wú)菌條件下接入液體菌種，按下列實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)定多糖的收率。

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 菌齡對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 分別用24、48、72、96、120h不同菌齡的液體菌種，按10%接種發(fā)酵瓶，在25℃、110r/min、pH自然條件下培養(yǎng)5d，設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.2.1.2 接種量對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 采用48h菌齡分別按5%、10%、15%、20%、25%接種量接種發(fā)酵瓶，在25℃、110r/min、pH自然條件下培養(yǎng)5d，設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 采用48h菌齡按10%接種量接種發(fā)酵瓶，分別在21、23、25、27、29℃溫度水平、110r/min、pH自然條件下培養(yǎng)5d，設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.2.1.4 起始pH對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 采用48h菌齡按10%接種量接種發(fā)酵瓶，分別在6.0、6.5、7.0、7.5、8.0起始 pH水平、110r/min、25℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)5d，設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.2.1.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 分別用110、130、150、170、190r/min的轉(zhuǎn)速，48h菌齡、10%接種量接種發(fā)酵瓶、pH自然、25℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)5d，設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.2.1.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 發(fā)酵時(shí)間分設(shè)5、6、7、8、9d五個(gè)水平，48h菌齡、10%接種量接種發(fā)酵瓶、pH自然、110r/min、25℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)，設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果確定選入正交實(shí)驗(yàn)的因子及水平，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，選擇菌齡（A）、溫度（B）、搖床轉(zhuǎn)速（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）4個(gè)因素，各因素選取3個(gè)水平。然后參照正交表分別選擇4因素3水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表1），對(duì)金針菇液體發(fā)酵非營(yíng)養(yǎng)因子條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素水平表

1.2.3 多糖提取與測(cè)定 參照孫居明等的方法［13］。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 方差分析和顯著性分析采用DPS7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果分析

2.1.1 菌齡對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 不同菌齡接種后，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析和LSD法顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。由表2可知，不同菌齡接種對(duì)多糖產(chǎn)量的影響達(dá)顯著水平。由表3可以看出，當(dāng)菌齡在24～72h之間時(shí)，隨著菌齡的增長(zhǎng)，多糖的含量呈現(xiàn)極顯著提高，但隨菌齡的繼續(xù)增大，多糖含量反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。菌齡48、72h多糖收率較高，且與其它水平均達(dá)到極顯著性差異，故將48～72h菌齡確定為正交實(shí)驗(yàn)的水平區(qū)間。

表2 菌齡單因素實(shí)驗(yàn)方差分析

表3 菌齡對(duì)多糖產(chǎn)量影響的顯著性分析

注：不同小寫字母表示0.05水平上差異顯著；不同大寫字母表示0.01水平上差異顯著，表5、表7、表9、表11、表13同。

2.1.2 接種量對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 對(duì)不同接種量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和LSD法顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表4、表5。由表4可知，不同接種量對(duì)多糖產(chǎn)量的影響達(dá)顯著水平。由表5可以看出，當(dāng)接種量在10%～25%之間時(shí)，多糖的含量無(wú)顯著性差異，但分別與接種量5%相比，均呈極顯著性差異，且前者多糖的含量較高。在實(shí)際生產(chǎn)中，為了節(jié)約成本，10%的接種量即為金針菇F19液體發(fā)酵多糖產(chǎn)量的最佳接種量。

表4 接種量單因素實(shí)驗(yàn)方差分析

表5 接種量對(duì)多糖產(chǎn)量的影響的顯著性分析

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 對(duì)不同發(fā)酵溫度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和LSD法顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表6、表7。由表6可知，不同溫度對(duì)多糖產(chǎn)量的影響達(dá)顯著水平。由表7可以看出，在0.05和0.01顯著水平上，25、27℃之間和23、29、21℃之間均無(wú)顯著差異，但它們分別與其它水平均存在極顯著性差異，且前者多糖的含量明顯高于后者，可見(jiàn)應(yīng)將25～27℃納入正交實(shí)驗(yàn)再進(jìn)行篩選。

表6 發(fā)酵溫度單因素實(shí)驗(yàn)方差分析

表7 發(fā)酵溫度對(duì)多糖產(chǎn)量的影響的顯著性分析

2.1.4 起始pH對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 對(duì)不同起始pH發(fā)酵培養(yǎng)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和LSD法顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表8、表9。由表8可知，不同起始pH發(fā)酵培養(yǎng)所得多糖產(chǎn)量的影響呈顯著差異。由表9可見(jiàn)，起始pH7.5分別與其他水平呈極顯著差異，而其他水平之間無(wú)顯著性差異，且起始pH7.5時(shí)所得多糖含量達(dá)最高，是液體發(fā)酵最佳起始pH。

表8 起始pH單因素實(shí)驗(yàn)方差分析

表9 起始pH對(duì)多糖產(chǎn)量影響的顯著性分析

2.1.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 對(duì)不同搖床轉(zhuǎn)速發(fā)酵培養(yǎng)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和LSD法顯著性分析，見(jiàn)表10、表11。由表10可知，不同搖床轉(zhuǎn)速發(fā)酵培養(yǎng)所得多糖產(chǎn)量的影響呈顯著差異。由表11可見(jiàn)，搖床轉(zhuǎn)速在130～170r/min間無(wú)顯著性差異，與110、190r/min比較其多糖產(chǎn)量較高，故擬將130～170r/min水平納入正交實(shí)驗(yàn)。

表10 轉(zhuǎn)速單因素實(shí)驗(yàn)方差分析

表11 轉(zhuǎn)速對(duì)多糖產(chǎn)量的影響的顯著性分析

2.1.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多糖產(chǎn)量的影響 對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間培養(yǎng)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和LSD法顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表12、表13。由表12可知，不同發(fā)酵時(shí)間培養(yǎng)所得多糖產(chǎn)量的影響呈顯著差異。由表13可見(jiàn)，7～8d多糖產(chǎn)量達(dá)到峰值，第9d開始下降。故將7～8d納入正交實(shí)驗(yàn)。

表12 發(fā)酵時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)方差分析

表13 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多糖產(chǎn)量的影響的顯著性分析

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

按L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表的各種條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表14。由表14可以看出，影響多糖產(chǎn)量的各個(gè)因素主次排序?yàn)锽＞A＞D＞C，最佳金針菇液體發(fā)酵非營(yíng)養(yǎng)因子發(fā)酵條件為：A1B2C1D2，即菌齡48h、溫度26℃、搖床轉(zhuǎn)速130r/min、發(fā)酵時(shí)間7.5d，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，多糖得率1.86mg/mL。

3 結(jié)論

綜合單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可得，金針菇F19液體發(fā)酵多糖產(chǎn)量最大收率的非營(yíng)養(yǎng)因子發(fā)酵條件為菌齡48h、接種量10%，起始pH7.5，發(fā)酵溫度26℃、搖床轉(zhuǎn)速130r/min、發(fā)酵時(shí)間7.5d，多糖得率1.86mg/mL。

表14 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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Effects of non-nutritional factors for liquid fermentation of Flammulina Velutipes on the yield of polysaccharide

ZHU Jian-yong
（College of Life Sciences and Technology，Chongqing University of Arts and Sciences，Chongqing 402168，China）

The aim was to study the optimum non-nutritional factors for liquid fermentation of Flammulina Velutipes of F19 to obtain polysaccharide.Using single factor experiments and orthogonal tests，the effect of non-nutritional factors on the yield of polysaccharide by liquid fermentation of Flammulina velutipes was studied.The results showed that the optimum condition of liquid fermentation on the biggest yield of polysaccharide was seed age 48h，inoculation amount 10%，initial pH 7.5，culture temperature 26℃，rotational speed 130r/min and fermentation time 7.5d，the yield of polysaccharide was 1.86mg/mL。

Flammulina velutipes；non-nutritional factors；liquid fermentation；polysaccharide

TS201.3

A

1002-0306（2010）12-0182-03

2009-12-07

朱建勇（1966-），男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：應(yīng)用微生物。

重慶文理學(xué)院重點(diǎn)資助項(xiàng)目（Z2008SK18）。