章萍萍，趙培城

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310014）

純牛奶中18碳TFA及9C,11 T-CLA含量的測定研究

章萍萍，趙培城

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310014）

為了精確測量出純牛奶中18碳TFA及9c，11t-CLA的含量，本實驗通過毛細(xì)管氣相色譜法，并采用內(nèi)標(biāo)法，對純牛奶進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，純牛奶中18碳脂肪酸的質(zhì)量百分比約為35.43%，18碳TFA的質(zhì)量百分比約為2.27%，而其中C18∶1-11t的質(zhì)量百分比達(dá)到1.28%，占所有18碳TFA的一半以上，約為56.36%，同時，牛奶中C18∶2-9c，11t的質(zhì)量百分比只為0.11%，其含量遠(yuǎn)少于TFA。

純牛奶，18碳反式脂肪酸，9c，11t-共軛亞油酸，毛細(xì)管氣相色譜法，內(nèi)標(biāo)法

食品是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，隨著科技的進(jìn)步和人們健康意識的增強(qiáng)，相比食品的色香味，人們更看重食品的營養(yǎng)價值和安全性。脂肪含有對人體生長、代謝有影響的脂肪酸，包括飽和脂肪酸（SFA）、順式脂肪酸（CFA）、反式脂肪酸（TFA）、共軛脂肪酸（CLA）等，這些脂肪酸具有廣泛的生理活性和生物學(xué)效應(yīng)。已有研究表明，TFA會增加患心血管病的危險性，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，特別是對嬰幼兒和兒童的危害更大，會增加孩子的學(xué)習(xí)障礙，抑制生長發(fā)育等［1］。而CLA具有提高機(jī)體免疫機(jī)能、防止動脈粥樣硬化、抗氧化等作用［2］。牛奶含有人體所需要的全部營養(yǎng)物質(zhì)，是全營養(yǎng)食物，尤其是嬰幼兒和兒童最主要的食物來源之一，在三聚氰胺事件以后，人們對牛奶中各成分的含量更加關(guān)注，牛奶中脂肪酸的構(gòu)成及對其質(zhì)量的影響也逐漸引起人們的重視。本實驗用毛細(xì)管氣相色譜法精確測定了純牛奶中18碳TFA及9c，11t-CLA的含量，并進(jìn)一步評價了純牛奶的營養(yǎng)價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

純牛奶樣品 杭州新希望雙峰乳品，購于超市；C17∶0、C18∶1-11t、C18∶2-9t，12t、C18∶2-9c，12t、C18∶2-9t，12c、C18∶2-9c，12c、C18∶3-9t，12t，15t、C18∶3-9c，12c，15c脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品；C18∶3-9t，12t，15c、C18∶3-9t，12c，15t、C18∶3-9c，12t，15t脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品；C18∶3-9c，12c，15t、C18∶3-9c，12t，15c、C18∶3-9t，12c，15c脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品；C16∶0、C18∶0、C18∶1-9c、C18∶1-9t、C18∶1-11c、C18∶2-9c，11t、C20∶0脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氟化硼甲醇溶液 分析純，Sigma公司；體積分?jǐn)?shù)為25%的氨水溶液、無水乙醇、乙醚、石油醚、氮氣、正已烷 均為分析純；2mol/L KOH-甲醇溶液取11.202g KOH，溶于約50mL無水甲醇中（溫和加熱，不得用明火加熱），冷卻至室溫，用甲醇定容至100mL，加入約5g無水硫酸鈉，充分?jǐn)嚢韬筮^濾，保留濾液。

ZFQ-85B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海醫(yī)械專機(jī)廠；日本島津GC-2010型氣相色譜儀 配有氫火焰離子化檢測器，島津儀器有限公司；CP-Sil88型石英交聯(lián)毛細(xì)管柱 100m×0.25mm×0.20μm，南京伽諾儀器儀表有限公司。

式中：ms-加入樣品中的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（C17∶0）的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；As-加入樣品中的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（C17∶0）的包譜峰面積；Ai-成分i脂肪酸的色譜峰面積；m-稱取脂肪的質(zhì)量，單位為毫克（mg）。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的制備 分別稱取一定量的C16∶0、C18∶0、C18∶1-9c、C18∶1-9t、C18∶1-11c、C18∶2-9c，11t、C20∶0脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品于50mL圓底燒瓶中，加入10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氟化硼甲醇溶液，回流1h后，從冷凝管頂部加入正已烷，混合后取下冷凝管，加入20mL飽和NaCl溶液，劇烈振搖，繼續(xù)加入飽和NaCl溶液至燒瓶頸部，靜置分層，取上清液，得脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品一［3］。

將C18∶1-11t、C18∶2-9t，12t、C18∶2-9c，12t、C18∶2-9t，12c、C18∶2-9c，12c、C18∶3-9t，12t，15t、C18∶3-9c，12c，15c、C18∶3-9t，12t，15c、C18∶3-9t，12c，15t、C18∶3-9c，12t，15t、C18∶3-9c，12c，15t、C18∶3-9c，12t，15c、C18∶3-9t，12c，15c脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品混合，用正已烷定容，得脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品二。

將C17∶0脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品用正已烷定容，得其濃度為9.29mg/mL。

將脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品一、脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品二、C17∶0脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品混合，即得脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.2 純牛奶中脂肪的提?。?］量取200mL純牛奶于1000mL燒杯中，加入100mL體積分?jǐn)?shù)為25%的氨水溶液，置于65℃水浴中加熱約50min，每隔5min用玻璃棒攪拌一次，取出后冷卻至室溫。加100mL無水乙醇，混勻。加入250mL乙醚，振搖1min，加入250mL石油醚，振搖1min。靜止分層，有機(jī)層轉(zhuǎn)入1000mL圓底燒瓶中。第二次提取加入的試劑為100mL乙醇、200mL乙醚、200mL石油醚，操作同前。第三次提取不加乙醇，只加150mL乙醚、150mL石油醚，如上操作。把提取的醚液合并，在40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，再用氮氣吹干，經(jīng)真空干燥至恒重，即得乳脂樣品，稱重，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 乳脂樣品的甲酯化［5］稱取一定量乳脂樣品，用正已烷配成濃度為1.004mg/mL的乳脂樣品溶液，取3mL該溶液，加入2mL 2mol/L KOH-甲醇溶液，振搖至溶液澄清，靜置分層，取1mL上清液，加入20μL 9.29mg/mL C17∶0脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品做內(nèi)標(biāo)物，用于氣相色譜分析；另取1mL上清液，直接用于氣相色譜分析，作為對照。

1.2.4 氣相色譜分析條件［5］色譜柱：CPTM-Sil 88 FAME毛細(xì)管石英柱（100m×0.25mm×0.25μm）；柱溫：初始溫度60℃，保持5min，以5℃/min升溫至165℃，保持1min，再以2℃/min升溫至225℃，保持17min；檢測器：氫焰離子化檢測器（FID）；檢測器溫度：250℃；進(jìn)樣口溫度：250℃；氫氣流速：30mL/min；空氣流速：400mL/min；進(jìn)樣方式：自動進(jìn)樣；載氣：氮氣，純度不低于99.99%；柱流量：1.22mL/min；不分流。

1.2.5 結(jié)果計算 某種脂肪酸占總脂肪的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（Xi）按下式計算：

2 結(jié)果與討論

2.1 峰的鑒定

圖1為脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的氣相圖譜。由圖1可以看出，該氣相色譜分析方法能使不同結(jié)構(gòu)的脂肪酸甲酯得到很好的分離，同時可以得出，脂肪酸甲酯的保留時間與碳鏈長度、不飽和度及順反構(gòu)型等因素有關(guān)。隨著碳數(shù)的增加，脂肪酸甲酯的出峰時間推遲，但C20∶0的出峰時間在C18∶2與C18∶3之間；相同碳數(shù)的脂肪酸甲酯不飽和度越大，保留時間越長，即保留時間：C18∶0＜C18∶1＜C18∶2＜C18∶3，但9c，11t-CLA的出峰時間在C18∶3-9c，12c，15c之后；相同碳數(shù)、相同不飽和度的脂肪酸甲酯，順式脂肪酸甲酯比反式脂肪酸甲酯的出峰時間晚，即保留時間：順式脂肪酸＞反式脂肪酸；相同碳數(shù)，相同構(gòu)型的脂肪酸甲酯的保留時間受雙鍵位置的影響，雙鍵離酯?；奈恢迷竭h(yuǎn)，保留時間越長，即保留時間Δ9＜Δ11＜Δ12＜Δ15。

圖1 脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品氣相圖譜

2.2 乳脂樣品中脂肪酸含量的分析

為了精確測定乳脂樣品中脂肪酸含量，本實驗采用內(nèi)標(biāo)法，且內(nèi)標(biāo)物采用乳脂樣品中含量較少的C17∶0。圖2為未加C17∶0內(nèi)標(biāo)物的乳脂樣品氣相圖譜，圖3為加C17∶0內(nèi)標(biāo)物的乳脂樣品氣相圖譜。

將圖2及圖3相比較可以看出，加內(nèi)標(biāo)物與未加內(nèi)標(biāo)物的乳脂樣品氣相圖譜的重合性非常好，同時，飽和脂肪酸、順式脂肪酸、反式脂肪酸及共軛脂肪酸能夠很好地分離，因此可通過記算C17∶0的峰面積來計算乳脂中不同脂肪酸的含量。

通過計算，可以得出，乳脂中18碳脂肪酸的質(zhì)量百分比約為35.43%，18碳反式脂肪酸的質(zhì)量百分比約為2.27%，而其中C18∶1-11t的質(zhì)量百分比達(dá)到1.28%，占所有18碳反式脂肪酸的一半以上，約為56.36%。同時，乳脂樣品中C18∶2-9c，11t的質(zhì)量百分比只為0.11%。

注：1：C16∶0；2：C17∶0；3：C18∶0；4：C18∶1-11t；5：C18∶1-9c；6：C18∶2-9c，12c；7：C18∶3-9c，12c，15c；8：C18∶2-9c，11t，圖3同。

圖3 乳脂樣品氣相圖譜（加C17∶0內(nèi)標(biāo)物）

目前國際對食品中反式脂肪酸含量的限量標(biāo)準(zhǔn)為少于2%，而通過本實驗的測定可知，純牛奶中僅18碳反式脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)就達(dá)到約2.27%，其含量還是偏高，共軛亞油酸由于其具有提高機(jī)體免疫機(jī)能、防止動脈粥樣硬化、抗氧化等作用，故在牛奶中應(yīng)提高CLA的含量，通過本實驗的檢測可知，牛奶中CLA的含量遠(yuǎn)少于TFA，因此對于牛奶中反式脂肪酸消解技術(shù)的研究迫在眉睫，而這其中尤其是對C18∶1-11t的消解。在反芻動物體內(nèi)，C18∶1-11t可在肝臟和乳腺細(xì)胞中被 Δ9脫氫酶脫氫，生成9c，11t-CLA。Pollard等人［6］曾從大鼠的肝臟微粒體中分離得到Δ9脫氫酶，據(jù)此，可進(jìn)一步研究利用Δ9脫氫酶將C18∶1-11t轉(zhuǎn)化成9c，11t-CLA的體外實驗過程，從而達(dá)到既減少牛奶中TFA含量，又增加CLA含量的效果。

3 結(jié)論

本實驗通過毛細(xì)管氣相色譜法，利用內(nèi)標(biāo)法，對純牛奶中18碳反式脂肪酸及9c，11t-CLA的含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果得出，純牛奶中18碳脂肪酸的質(zhì)量百分比約為35.43%，18碳反式脂肪酸的質(zhì)量百分比約為2.27%，而其中C18∶1-11t的質(zhì)量百分比達(dá)到1.28%，占所有18碳反式脂肪酸的一半以上，約為56.36%，這離國際對食品中反式脂肪酸含量的限量標(biāo)準(zhǔn)2%還有一定差距。同時，牛奶中C18∶2-9c，11t的質(zhì)量百分比只為0.11%，其含量遠(yuǎn)少于TFA，因此可利用Δ9脫氫酶將C18∶1-11t轉(zhuǎn)化成9c，11t-CLA，從而達(dá)到既減少牛奶中TFA含量，又增加CLA含量的效果。

［1］賴曉英，武德銀，伍飏，等.反式脂肪酸的危害及其檢測方法［J］.現(xiàn)代食品科技，2006，23（2）：73-76.

［2］王麗芳，盧德勛，馬燕芬.共軛亞油酸的來源及其生物學(xué)作用［J］.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2008（2）：93-96.

［3］GB/T 17376-2008/ISO 5509：2000.動植物油脂脂肪酸甲酯制備［S］.

［4］吳廣臣.食品質(zhì)量檢驗［M］.北京：中國計量出版社，2008：65-67.

［5］GB/T 22110—2008.食品中反式脂肪酸的測定氣相色譜法［S］.

［6］Pollard M R，Gunstone F D，James A T，et al.Desaturation of Positional and Geometric Isomers of Monoenoic Fatty Acids by Microsomal Preparations from Rat Liver［J］.Lipids，1980，15（5）：306-314.

Study on 18-carbon trans fatty acid and 9c，11t-conjugated linoleic acid contents in milk

ZHANG Ping-ping，ZHAO Pei-cheng
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

ln order to determine the contents of 18-carbon TFA and 9c，11t-CLA in milk，internal standard method of capillary column-gas chromatography was used.According to the result，the mass percents of 18-carbon fatty acids，18-carbon TFA，C18∶1-11t in milk were about 35.43%，2.27%，1.28%，respectively.And more than half of 18-carbon TFA in milk was C18∶1-11t，about 56.36%.But the mass percent of C18∶2-9c，11t in milk was only about 0.11%，which was much less than the 18-carbon TFA contents of milk.

milk；18-carbon trans fatty acid；9c，11t-conjugated linoleic acid；capillary column-gas chromatography；internal standard

TS252.7

A

1002-0306（2010）12-0355-03

2010-01-19

章萍萍（1985-），女，在讀碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。