師文添，趙大云

（1.江蘇食品職業(yè)技術學院，江蘇淮安223003；2.上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海200240）

ELSD-HPLC測定大豆皂苷含量

師文添1，趙大云2

（1.江蘇食品職業(yè)技術學院，江蘇淮安223003；2.上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海200240）

建立了以馬萘雌酮為內標物，通過ELSD-HPLC內標法測定大豆皂苷Ab、Bb的定量方法，各自分別在0.1～0.5mg/mL范圍內呈良好的線性關系，具有較高的回收率、穩(wěn)定性和重現性。通過大豆皂苷Ab、Bb分別定量A組、B組大豆皂苷，并通過此兩組皂苷近似計算大豆總皂苷含量。

大豆皂苷，ELSD，HPLC，檢測

大豆皂苷是存在于大豆中的一類五環(huán)三萜類齊墩果烷型皂苷，由非極性的三萜苷元（aglycones或sapogenol）和低聚糖鏈（glycones）兩部分組成，日本學者北川熏和大久保一良按照苷元的不同，將其分為A類，B類，E類和DDMP類［1］。根據Kudou［2］等的研究發(fā)現，DDMP類皂苷是B組皂苷在大豆中的天然存在形式。E類皂苷是3組皂苷中含量最少的，有研究認為它是B類皂苷的光氧化產物［3］。同時各類皂苷又是由不同單體皂苷組成。已有研究報道大豆皂苷具有抗癌、調節(jié)免疫功能、降低血清中膽固醇含量、防治心血管疾病、抗菌、抗病毒、護肝、減肥等多重生理功效［4-7］，且不同類大豆皂苷在生物學功能上表現出不同。目前，對大豆皂苷含量的測定的研究多集中在總皂苷，以不同的測定方法得到的總皂苷的含量相差很大。對各族大豆皂苷、大豆皂苷單體以及大豆總皂苷的研究開發(fā)迫切需要建立一個快速簡便、相對準確的定量方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬萘雌酮、乙腈 色譜純，SIGMA，美國；大豆胚芽粉 黑龍江九三油脂有限公司，大豆胚芽經粉碎過40目篩。

旋轉蒸發(fā)儀 BüCHI，德國；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；AB204-N電子天平、PB2002-N電子天平METTLER TOLEDO，瑞士；超聲清洗機 MISONIX，美國；SZ-93自動雙重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠；高效液相色譜儀系統(tǒng) 包括717Plus自動進樣器、2996二極管陣列檢測器，WATERS，美國；蒸發(fā)光散射檢測器 ALLTECH 2000，美國；無音無油空壓機WYK-2 天津市藍珂科技實業(yè)公司；Mili-Q超純水系統(tǒng) MILI-Q，美國。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備 從脫脂大豆胚芽中分離提取總皂苷，以制備HPLC分離出2種皂苷單體，以LC-MS等方法鑒定為大豆皂苷Ab和Bb，通過高效液相色譜分析其峰面積百分數達到98%以上［8］。分別精密稱取對照品大豆皂苷Ab 5mg，大豆皂苷Bb 5mg，分別用50%甲醇水溶液溶解并定容至1mL，即得5mg/mL大豆皂苷Ab溶液，5mg/mL大豆皂苷Bb溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 稱取大豆胚芽粉（水分含量為8.86%）20g，用石油醚（30～60℃）脫脂3h，取出揮干石油醚后，再用200mL的70%的乙醇水溶液浸提4h，旋轉蒸發(fā)回收乙醇相，水相上AB-8大孔吸附樹脂柱（30mm×800mm，樹脂床層高150mm）吸附過夜，經多次水洗去除糖等雜質后，用乙醇水溶液洗脫大豆皂苷，回收溶劑后用水定容至100mL。從中取0.20mL，加入濃度為100ng/μL的內標（馬萘雌酮）溶液750μL。

1.2.3 高效液相色譜分析條件 Aquasil RP C18（150mm×4.6mm，3μm）色譜柱；流動相A：0.001%（V/V）乙酸水溶液，流動相B：0.001%（V/V）乙酸乙腈溶液；流動相流速：1mL/min；溫度：30℃；蒸發(fā)光散射檢測器（溫度40℃，氣壓2.3bar），PDA二極管陣列檢測器（200～800nm）；HPLC梯度洗脫程序：0～10min，10%B溶液；10～30min，10%～30%B溶液（線性增加）；30～80min，30%～40%B溶液（線性增加）；80～90min，40%～100%B溶液（線性增加）；90～110min，100%B溶液；110～120min，10%B溶液。

1.2.4 線性關系考察 分別精密吸取對照品溶液大豆皂苷Ab（20、40、60、80、100μL）、大豆皂苷Bb（20、40、60、80、100μL）到5只1mL試管中，再分別加入濃度為100ng/μL的馬萘雌酮內標溶液750μL，定容至1mL，得到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL系列濃度的對照品混合溶液，分別進樣3針，每次進樣20μL，記錄色譜圖，以對照品濃度的常用對數為橫坐標，以對照品與內標物的面積比的常用對數為縱坐標，進行線性回歸。

1.2.5 精密度實驗 取上述對照品混合溶液，連續(xù)進樣5次，測得各次峰面積，計算RSD。

1.2.6 重復性實驗 平行5份供試品按照1.2.4方法測定其含量，計算RSD。

1.2.7 回收率實驗 精密稱取5份已測知含量的樣品100μL，分別加入上述對照品混合溶液20、40、60、80、100μL，加入濃度為 100ng/μL的內標溶液750μL，定容至1mL。按上述方法進樣測定。

1.2.8 樣品測定 以黑龍江產水分含量為8.86%的大豆胚芽為原料，稱取20mg，平行2份，按照1.2.2方法制備待試品，但其中1份在浸提之前采用180W、室溫超聲預處理45min，另1份未經超聲波預處理，按照上述方法比較測定大豆皂苷Ab、大豆皂苷Bb，以及各組皂苷含量、總皂苷含量。

2 結果與分析

圖1為標準品Ab、Bb與內標物馬萘雌酮混合樣品分析圖。圖中各標準品、內標物蒸發(fā)光散射檢測信號很好，基線平穩(wěn)，雜質極少，各峰未有重疊拖尾現象。

圖1 大豆皂苷標準品與內標物反相HPLC-ELSD檢測色譜圖

2.1 線性關系考察

以對照品進樣量（μg）的常用對數為橫坐標，以對照品與內標物的面積比的常用對數為縱坐標，繪制標準曲線，見圖2。大豆皂苷Ab線性回歸方程為：lgy=1.6658lgx-0.7123，R2=0.9995，重復測定次數p=2。大豆皂苷Bb線性回歸方程為：lgy=1.8734lgx-0.9667，R2=0.9998，重復測定次數p=2。經統(tǒng)計學分析，進樣量對實驗結果有顯著影響，進樣量的常用對數與對照品和內標物的面積比的常用對數存在顯著的線性關系，回歸的精度良好。

圖2 回歸曲線

2.2 精密度實驗

測得大豆皂苷Ab與內標物峰面積值之比8.98%±0.26%，RSD為0.03%，大豆皂苷Bb與內標物峰面積值之比8.17%±0.20%，RSD為0.02%。結果表明實驗的精密度良好。

2.3 重復性實驗

按照1.2.4方法測定供試品含量，Ab平均含量為0.97% ±0.01%，RSD為 0.69%；Bb平均含量為0.90%±0.01%，RSD為0.22%。結果表明實驗的重復性良好。

2.4 回收率實驗

按1.2.7方法測定加標回收率，結果見表1。大豆皂苷Ab回收率平均值為99.12%，RSD為0.84%；大豆皂苷 Bb回收率平均值為 98.86%，RSD為0.98%。結果表明樣品具有較高的回收率。

2.5 樣品含量測定

對供試樣品含量測定結果表明，經過超聲波輔助提取樣品 Ab皂苷含量 0.97%，Bb皂苷含量0.90%，A組皂苷含量1.59%，B組皂苷含量0.97%，總皂苷含量2.55%。未經超聲波輔助提取樣品Ab皂苷含量0.83%，Bb皂苷含量0.80%，A組皂苷含量1.32%，B組皂苷含量0.87%，總皂苷含量2.18%。經過超聲波預處理樣品的各類單體皂苷以及總皂苷都比未經超聲波處理樣品含量高。

3 討論

目前，皂苷的定量常用的方法有氣相色譜法（GC）、薄層色譜法（TLC）、香草醛-高氯酸比色法和高效液相色譜法（HPLC）。GC中苷元還要衍生化。薄層色譜法（TLC）操作步驟多，很繁瑣［9］。香草醛-高氯酸法是最廣泛采用的皂苷顯色法，但皂苷顯色法測試所用的對照品不一，就大豆皂苷而言，有用人參皂苷Rb1［10］，齊墩果酸［11-12］，還有以各種不同方式自制的標準品，這就造成了測試結果的差異性。HPLC法可以準確檢測各種單一皂苷的量，但使用紫外檢測器（檢測波長為205nm）干擾較大，一個很好的方法是采用紫外檢測器與蒸發(fā)光散射檢測器對照。蒸發(fā)光散射檢測已經成功地應用于酸棗仁皂苷［13］、人參皂苷［14］的定量分析與檢測。通過本實驗摸索結果證明監(jiān)測基線相對比較穩(wěn)定，蒸發(fā)光散射對于大豆皂苷的監(jiān)測效果很好，通過紫外檢測與蒸發(fā)光散射檢測器并用對比，能夠使檢測結果更加準確。

表1 加標回收實驗結果

在各類大豆皂苷中，E類皂苷含量很低，通過Ab標準曲線可以用來定量乙?；腿ヒ阴；腁類皂苷，通過Bb標準曲線可以用來定量B類皂苷。用高效液相色譜定量常采用外標法，但實際測試過程中很難保證每次色譜條件完全相同，本文選用馬萘雌酮為內標物，采用內標法，使測試結果更加可靠。

Decroos［14］測定大豆胚芽中A組皂苷總含量的變化范圍在1.5%±0.1%到2.8%±0.2%，B組大豆皂苷總含量的變化范圍在1.2%±0.1%到2.0%±0.1%，總皂苷含量最高約為4.4%，本文結果比其結果偏低。谷利偉［15］等用大豆皂苷直接比色法測定脫脂胚芽中皂甙的含量為4.82%。陸世榮［4］報道大豆胚芽中皂甙的含量約3%～4%。Shiraiwa［16］報道的大豆皂苷含量范圍0.62%到6.16%，本實驗測得大豆胚芽中大豆皂苷含量比文獻［7，9］報道偏低，但在Shiraiwa報道的范圍內。

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Determination of soya saponins by ELSD-HPLC

SHI Wen-tian1，ZHAO Da-yun2
（1.Jiangsu Food Science College，Huai’an 223003，China；2.School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China）

The quantitative method of soya saponin Ab and Bb by ELSD-HPLC were established using equilenin as internal standard.The results showed that the method was sufficiently accurate for assays in series.The linear relationship was good 0.1～0.5mg/mL within the scope，respectively.The content of group A，group B soya saponins and total soya saponins were calculated approximately by the two single purified soya saponins.

soya saponin；ELSD；HPLC；determination

TS210.1

A

1002-0306（2010）12-0346-03

2009-12-28

師文添（1981-），男，碩士，研究方向：功能食品。

上海市科委標準化專項資助項目（05DZ05001）。