亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        海藻和海藻酸鈉中糖醛酸含量的測定

        2010-11-10 01:20:06張文婧李靜梅
        食品工業(yè)科技 2010年12期
        關(guān)鍵詞:標準

        張文婧,李靜梅,吳 穎,梁 平,石 波,*

        (1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所,北京100081;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所,北京100081;3.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所,北京100026)

        海藻和海藻酸鈉中糖醛酸含量的測定

        張文婧1,李靜梅2,吳 穎3,梁 平1,石 波1,*

        (1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所,北京100081;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所,北京100081;3.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所,北京100026)

        利用陰離子交換樹脂對酸水解后的海藻酸鈉進行分離,得到D-甘露糖醛酸(M)和L-古洛糖醛酸(G),經(jīng)過高效液相色譜、電噴質(zhì)譜及核磁共振確定其純度和結(jié)構(gòu)。利用自制的M和G作為標準品繪制標準曲線,用外標法計算得到海藻酸鈉樣品中M含量為63.06%,G含量為11.48%;海藻樣品中M含量為21.65%,G含量為4.67%。該實驗為海藻膠及海藻寡糖中的D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸含量的測定奠定了一定的基礎(chǔ)。

        D-甘露糖醛酸,L-古洛糖醛酸,高效液相色譜,檢測

        海藻中的海藻酸是由D-甘露糖醛酸(D-Mannuronic Acid,簡稱 M)和 L-古洛糖醛酸(L-Guluronic Acid,簡稱G)組成的一種酸性多糖。其因主鏈上連接的M和G位置的不同而決定了其結(jié)構(gòu)的不同,理化性質(zhì)隨著M/G比例而改變,相應(yīng)的M/G比例也決定了在食品、醫(yī)藥和紡織等方面的不同用途。Patrick等曾對已攝入Sr-85的動物飼喂M/G具有不同比值的海藻酸鈉進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)海藻酸鈉中G的含量增高時能有效地抑制Sr-85在動物體內(nèi)的吸收[1]。目前在工業(yè)上使用的是海藻酸的鈉鹽即海藻酸鈉。因此,快速、準確地測定出海藻和海藻酸鈉中M和G的含量具有極其重要的價值,其結(jié)構(gòu)見圖1。由于高純度的M和G單一組分規(guī)模化制備具有一定的難度,因此目前通常采用核磁共振(NMR)的方法測定海藻和海藻酸鈉中M和G的含量[2-3],該方法需要核磁共振儀器和專業(yè)儀器操作人員,這極大地制約了對于褐藻和海藻酸以及鈉鹽的研究和應(yīng)用。本研究首先以海藻酸鈉為原料,制備出高純度的D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸單一組分,然后選擇高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,簡稱HPLC)的方法,將所得到的M和G作為標準品,測定海藻和海藻酸鈉中兩種糖醛酸M和G的比值和含量,以實現(xiàn)海藻及海藻酸鈉中M和G含量的快速、準確測定。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        海藻 山東蓉城2007年產(chǎn),粉碎機粉碎;海藻酸鈉、無水碳酸鈣、氫氧化鈉 國藥集團化學(xué)試劑公司,分析純;硫酸、鹽酸、冰醋酸 北京化工廠,分析純;1×8陰離子交換樹脂 美國Dowex,200目;重蒸水,蒸餾水。

        圖1 D-甘露糖醛酸結(jié)構(gòu)和L-古洛糖醛酸結(jié)構(gòu)

        Waters 2695高效液相色譜儀 附配有 Waters 2414示差檢測器,美國Waters公司;AR 2140分析天平 感量:0.0001g,美國奧豪斯公司;FD-1D真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;RVC 2-18旋轉(zhuǎn)真空離心濃縮儀 德國Christ;BSZ-30自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠;IKA加熱磁力攪拌器德國IKA;APEXII型FT-ICR質(zhì)譜儀 美國Bruker Daltonic;Bruker ARX-400核磁共振儀 瑞士Bruker;常壓玻璃層析柱 Φ45×450mm,中國科學(xué)院過程研究所;Silica Gel F254硅膠板 MERCK;烘箱 350± 1℃,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;FW100高速萬能粉碎機 24000r/min,天津泰斯特儀器有限公司。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 色譜條件 色譜柱:ZORBAX SAX 4.6× 250mm 5-Micron Agilent;柱溫:40℃;流動相:0.7mol/L乙酸;流速:1.0mL/min;測定波長:示差檢測;示差檢測器溫度:40℃;進樣量:10μL[4]。

        1.2.2 D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸的制備 稱取海藻酸鈉5g,加入76%的硫酸50mL,常溫下攪拌反應(yīng)2.5h,再加入650mL蒸餾水,沸水浴中水解3h,冷卻后加稍過量的無水CaCO3中和,抽濾,并用蒸餾水洗滌濾渣兩次,合并濾液,40℃下真空濃縮至體積為5mL,用0.1mol/L NaOH調(diào)pH為8.0,并保持0.5h不變。

        取上述海藻酸鈉水解液上已轉(zhuǎn)為CH3COO-型的Dowex1×8陰離子交換樹脂柱,用0.5~2mol/L的乙酸溶液以2mL/min的速度進行梯度洗脫,用自動部分收集器收集,每瓶收集150mL,共收集60瓶。

        在每個收集瓶中取20μL液體,按順序點于硅膠板上,晾干后噴5%硫酸乙醇顯色劑,并于110℃烘箱中烘5min。

        按照薄層層析檢測結(jié)果,將相同組分的收集液合并,45℃真空濃縮后冷凍干燥,用HPLC分析其純度。并對其進行ESI-MS和1H NMR以及13C NMR測定,確定兩組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

        1.2.3 標準曲線的繪制 稱取制得G標準品,用重蒸水溶解,配制成濃度為 1.07、2.14、3.21、5.35、10.7mg/mL的標準溶液。稱取制得的M標準品,用重蒸水溶解,配制成濃度為1.2、6.0、12、24、30mg/mL的標準溶液。分別進樣10μL進行HPLC測定,以峰面積為縱坐標,相應(yīng)標準溶液的濃度為橫坐標,繪制標準曲線和進行線性回歸。

        1.2.4 樣品處理及檢測 準確稱取300mg(精確至± 0.0001g)海藻酸鈉,加入72%硫酸溶液3.5mL,于研缽中研磨2h,用100mL蒸餾水將其轉(zhuǎn)移至250mL三角瓶中,100℃沸水浴加熱2.5h,于自來水中冷卻至室溫,加入過量BaCO3粉末,充分反應(yīng)至溶液pH為7左右,3000r/min離心,沉淀用150mL蒸餾水洗滌3次,將上清液和洗滌液合并在一起,45℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮后,定容至10mL,進樣10μL進行HPLC測定。海藻樣品的處理方法同上,濃縮后定容至5mL,進樣10μL進行HPLC測定。依據(jù)樣品測定的峰面積和出峰時間,在相應(yīng)的標準曲線查出所測組分的量,結(jié)合所取樣品的質(zhì)量和定容體積,計算出各組分的含量。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸單一組分的分離純化

        硫酸水解海藻酸鈉所得產(chǎn)物見圖2。由圖2可知,海藻酸鈉酸水解產(chǎn)物含有2個主要組分A和B,保留時間分別為6.993min和7.934min。

        圖2 海藻酸鈉酸水解產(chǎn)物的HPLC譜圖

        將海藻酸鈉酸水解產(chǎn)物經(jīng)Dowex1×8陰離子交換樹脂層析柱分離,所得每個收集瓶中收集液薄層層析顯色,結(jié)果(圖3)表明,含有糖的洗脫液均有斑點顯示,并可以看出共有3組斑點,其中第一組為中性糖[5],第二組為組分A,第三組為組分B。

        圖3 陰離子交換樹脂層析柱分離所得收集液的TLC結(jié)果

        圖4和圖5分別為冷凍干燥得到的組分A和組分B的HPLC檢測譜圖。組分A的保留時間為7.008min,組分B的保留時間為10.557min。

        圖4 組分A的HPLC譜圖

        通過與圖2中保留時間的比較得知,組分A和B這兩種物質(zhì)在Dowex1×8陰離子交換樹脂為分離介質(zhì)、乙酸水溶液為洗脫液的層析柱中得到了有效地分離,且HPLC的分析純度(以峰面積百分比計)均達到99%以上。

        圖5 組分B的HPLC譜圖

        2.2 L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定

        將柱層析分離后所得的組分峰A和B分別收集,冷凍干燥后進行MS和1H NMR以及13C NMR檢測,確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

        組分峰A:1H-NMR(400MHz,D2O):α體,δ= 4.96(1H,d,J=8.4Hz,H-1),3.99(1H,d,J=3.6Hz,H-2),4.01(1H,d,J=3.6Hz,H-3),4.10(1H,s,H-4),4.58(1H,s,H-5);β體,δ=5.30(1H,d,J= 3.6HzH-1),3.70(1H,dd,J=8.4Hz,H-2),4.17(1H,d,J=4Hz,H-3),4.15(1H,d,J=3.6Hz,H-4),4.27(1H,s,H-5)。13C-NMR,(100MHz,D2O):α體,δ=92.98(C-1),66.91(C-2),70.89(C-3),70.65(C-4),73.56(C-5),175.06(C-6);β體,δ=93.65(C-1),68.60(C-2),71.10(C-3),70.76(C-4),73.56(C-5),174.08(C-6)。

        ESIMS m/z 193[M]+(100),C6H10O7。根據(jù)以上實驗數(shù)據(jù),確定組分峰A為L-古洛糖醛酸。

        組分峰B:1H NMR,(400MHz,D2O):α體,δ=5. 28(1H,d,J=2Hz,H-1),3.95(1H,d,J=4.4Hz,H-2),3.93(1H,d,J=1.6Hz,H-3),3.82(1H,s,H-4),4.26(1H,dd,J=5.4Hz,H-5);β體,δ=4.98(1H,s,H-1),3.99(1H,d,J=3.2Hz,H-2),3.80(1H,s,H-3),3.73(1H,d,J=2Hz,H-4),3.67(1H,s,H-5)。13C-NMR,(100MHz,D2O):α體,δ=93.85(C-1),68.28(C-2),70.27(C-3),70.07(C-4),72.42(C-5),175.05(C-6);β體,δ=93.99(C-1),68.73(C-2),71.02(C-3),69.61(C-4),72.81(C-5),174.56(C-6)。

        ESIMS m/z 193[M]+(100),C6H10O7。根據(jù)以上實驗數(shù)據(jù),確定組分峰B為D-甘露糖醛酸。

        2.3 海藻酸鈉中L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸含量的測定結(jié)果

        根據(jù)圖6,以L-古洛糖醛酸峰面積(Y)對應(yīng)質(zhì)量濃度(X,mg/mL)作回歸分析,得到回歸方程為y= 40396x-20326,R2=0.997。

        根據(jù)圖7,以D-甘露糖醛酸峰面積(Y)對應(yīng)質(zhì)量濃度(X,mg/mL)作回歸分析,得到回歸方程為:y=24689x-3244,R2=0.999。

        由圖6和圖7的結(jié)果可以得出,在1.07~10.7mg/mL范圍內(nèi),L-古洛糖醛酸具有良好的線性關(guān)系;在1.2~30mg/mL范圍內(nèi),D-甘露糖醛酸具有良好的線性關(guān)系。

        圖6 L-古洛糖醛酸標準曲線

        圖7 D-甘露糖醛酸標準曲線

        圖8 海藻酸鈉完全水解產(chǎn)物的HPLC譜圖

        圖8為海藻酸鈉完全水解產(chǎn)物的HPLC譜圖。按照外標法計算樣品中D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸的含量分別為63.06%和11.48%,M/G=5.493。用HPLC檢測獲得的峰面積比值代表樣品中M和G的含量比,海藻酸鈉中的M/G=3.20,誤差較大。選擇D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸標準品,建立相應(yīng)的標準曲線才能準確地測定出海藻酸鈉樣品中兩種糖醛酸的含量。

        2.4 海藻中G和M含量測定結(jié)果

        圖9為海藻中褐藻完全水解產(chǎn)物的HPLC譜圖,按照外標法計算褐藻樣品中D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸的含量分別為21.65%和4.67%,M/G= 4.636。而用HPLC檢測獲得的峰面積比值代表樣品中M和G的含量比,則褐藻中的M/G=2.819,與實際比值存在較大的誤差。

        圖9 褐藻完全水解產(chǎn)物的HPLC譜圖

        3 結(jié)論

        選擇Dowex1×8強堿型陰離子交換樹脂為制備型常壓柱層析的分離介質(zhì),乙酸水溶液為洗脫液,進行梯度洗脫,可以成功地從海藻酸鈉硫酸水解液中分離純化出L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸,兩組分純度分別達到99%以上。一次性上樣由5g海藻酸鈉制得的硫酸水解液,可獲得的L-古洛糖醛酸純品0.5839g,D-甘露糖醛酸純品1.7614g。采用本實驗制備的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸作為標準品,HPLC檢測,海藻酸鈉和褐藻中的L-古洛糖醛酸及D-甘露糖醛酸的含量分別為11.48%和63.06%以及4.67%和21.65%。本實驗為測定褐藻和海藻酸鈉中L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸的含量提供了一個方便、準確的方法。

        [1]Patrick G,Carr T E F,Humphreys E R.Inhibition by Alginates of Strontium Absorption Studied in Vivo and in Vitro[J].International Journal of Radiation Biology,1967,12:427-434.

        [2]Keiichiro M,Hironori M,Hajime K,et al.Decomposition Reaction of Alginic Acid Using Subcritical and Supercritical Water[J].Eng Chem Res,2005,44(25):9626-9630.

        [3]Riki Shiroma,Shuntoku Uechi,Shinkichi Tawata.Isolation and Characterization of Alginate from Hizikia fusiformis and Preparation of its Oligosaccharides[J].Journal of Applied Glycoscience,2007,54(2):85-90.

        [4]Voragen A G J,Schols H A,Devries J A,et al.Highperformance liquid chromatography analysis of uronic acid and oligogalacturonic acids[J].Journal of Chromatography,1982,244,327-336.

        [5]Haug A,Larsen B.Quantitative Determination of the Uronic Acid Composition of Alginates[J].Acta Chemica Scandinavica,1962,16,1908-1918.

        Quantitative determination of uronic acid in seaweeds and sodium alginate

        ZHANG Wen-jing1,LI Jing-mei2,WU Ying3,LIANG Ping1,SHI Bo1,*
        (1.Feed Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China;2.Institute of Crop Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China;3.Beijing Products Quality Supervision and Inspection Institute,Beijing 100026,China)

        The column chromatography with anion-exchange resin was used for isolating mannuronic acid(M)and guluronic acid(G)from hydrolyzed alginate sodium,the collected components were analyzed by high performance liquid chromatography(HPLC),ESl-MS and NMR.M and G was used as a standard,external reference method was used for assay of M and G in brown algae and alginate sodium.The concentration of M in brown algae was 21.65%and G was 4.67%,also alginate sodium has 63.06%M and 11.48%G.The experiment built a new method for quantitating D-mannuronic acid and L-guluronic acid in sodium alginate and seaweed oligosaccharides.

        D-mannuronic acid;L-guluronic acid;high performance liquid chromatography;detection

        TS254.1

        A

        1002-0306(2010)12-0338-04

        2010-04-08 *通訊聯(lián)系人

        張文婧(1984-),女,碩士研究生,主要從事天然產(chǎn)物與糖工程在飼料添加劑方面的研究。

        “十一五”國家海洋“863”課題(2007AA091601-2)。

        猜你喜歡
        標準
        2022 年3 月實施的工程建設(shè)標準
        忠誠的標準
        標準匯編
        上海建材(2019年1期)2019-04-25 06:30:48
        美還是丑?
        你可能還在被不靠譜的對比度標準忽悠
        一家之言:新標準將解決快遞業(yè)“成長中的煩惱”
        專用汽車(2016年4期)2016-03-01 04:13:43
        2015年9月新到標準清單
        標準觀察
        標準觀察
        標準觀察
        人禽无码视频在线观看| 寂寞人妻渴望被中出中文字幕| 黄片免费观看视频播放| 91盗摄偷拍一区二区三区| 国产人妖网站在线视频| 欧美xxxx做受欧美| 无码aⅴ在线观看| 欧美伊人亚洲伊人色综| 欧洲一级无码AV毛片免费| 国产av天堂一区二区二区| 偷看农村妇女牲交| 欧美一区二区三区激情| 免费人成年小说在线观看| 亚洲高清国产品国语在线观看| 久久精品国产在热亚洲不卡| 特级做a爰片毛片免费看| 51国产黑色丝袜高跟鞋| 亚洲男人天堂2017| 日产精品一区二区在线| 成年人观看视频在线播放| 无码乱人伦一区二区亚洲一 | 中文字幕人妻熟女人妻| 国精品无码一区二区三区在线蜜臀 | 一区二区三区高清在线观看视频| 最新亚洲人成网站在线观看| 狠狠躁夜夜躁人人爽天天不卡软件| 午夜精品久视频在线观看| 国产午夜精品视频观看| 97在线视频免费人妻| 三级在线看中文字幕完整版| 久久天堂av色综合| 国产色视频在线观看了| 亚洲国产精品无码专区在线观看| 亚洲人成无码网站久久99热国产| 午夜影视啪啪免费体验区入口| 伊人亚洲综合影院首页| 亚洲蜜臀av一区二区三区| 免费无码一区二区三区蜜桃大| av无码精品一区二区乱子| 熟女少妇丰满一区二区| 久久中文字幕亚洲综合|