劉 婭，劉宏娟，張建安，*，陳宗道

（1.西南大學(xué)食品學(xué)院，重慶400716；2.清華大學(xué)核能與新能源技術(shù)研究院，北京102201；3.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

響應(yīng)而法優(yōu)化CLOSTRIDIUM BEIJERINCKII 木糖發(fā)酵產(chǎn)丁醇培養(yǎng)基的研究

劉 婭1，2，3，劉宏娟2，張建安2，*，陳宗道1

（1.西南大學(xué)食品學(xué)院，重慶400716；2.清華大學(xué)核能與新能源技術(shù)研究院，北京102201；3.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

采用響應(yīng)面法對(duì)Clostridium beijerinckii利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，建立了回歸方程，得到了Cl.beijerinckii木糖發(fā)酵的優(yōu)化培養(yǎng)基組成為：木糖26.6g/L，酵母浸粉1.38g/L，維生素液5.55mL/L，微量元素液9.67mL/L。在此優(yōu)化條件下發(fā)酵，丁醇產(chǎn)量提高了18.4%，達(dá)到6.69g/L。

Clostridium beijerinckii，木糖，丁醇，培養(yǎng)基，響應(yīng)面法

受世界石油資源價(jià)格、環(huán)保和全球氣候變化的影響，發(fā)展生物燃料已成為許多國(guó)家提高能源安全、減排溫室氣體、應(yīng)對(duì)氣候變化的重要措施。生物丁醇以其能量密度高、腐蝕性小、對(duì)水的寬容度大、可以和汽油混合等許多優(yōu)于生物乙醇之處而受到世界各國(guó)的廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)的丁醇發(fā)酵工業(yè)以糧食為原料，生產(chǎn)成本高，隨著世界糧食危機(jī)的加重，現(xiàn)代的生物丁醇產(chǎn)業(yè)必然轉(zhuǎn)向價(jià)廉易得的木質(zhì)纖維類原料，如農(nóng)作物秸稈、廢棄農(nóng)產(chǎn)品、加工下腳料等非食用資源。由于木質(zhì)纖維類原料水解后產(chǎn)生的糖類物質(zhì)主要為木糖，因此，本文研究了以木糖為碳源Cl.beijerinckii的丁醇發(fā)酵，并利用響應(yīng)面法對(duì)其培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，從而為Cl.beijerinckii以纖維素水解液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的研究提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

拜氏梭菌（Clostridium.beijerinckii） 實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；種子培養(yǎng)基 酵母浸粉0.3%，牛肉膏1%，胰蛋白胨1%，可溶性淀粉0.1%，葡萄糖0.5%，L-半胱氨酸0.05%，NaCl 0.5%，NaAc 0.3%，pH8.5；斜面培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基另加瓊脂2%；P2培養(yǎng)基 木糖，酵母粉，P2營(yíng)養(yǎng)液。其中P2營(yíng)養(yǎng)液組成為［9-10］：a.維生素液：對(duì)-氨基苯甲酸0.01%，硫胺素0.01%，生物素0.0001%；b.微量元素液：MgSO4·7H2O 2%，MnSO4·H2O 0.1%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1%，NaCl 0.1%；c.緩沖液：KH2PO45%，K2HPO45%，NH4COOH 22%。接種前將緩沖液以0.5%比例加入P2培養(yǎng)基，維生素液和微量元素液按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)比例加入P2培養(yǎng)基中。

GC2010氣相色譜、LC-20AD液相色譜 日本島津公司；SPX-10013-2生化培養(yǎng)箱、SW-CJ-lF單人雙面垂直潔凈工作臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；TG16-W微量高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 從斜面培養(yǎng)基刮取菌落加入種子培養(yǎng)基，37℃ 靜置培養(yǎng)18h左右，至培養(yǎng)液在600nm處吸光值達(dá)到2.0時(shí)（6×109cfu/mL），接入P2發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 以10%接種量將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃下靜置培養(yǎng)72h后結(jié)束發(fā)酵，測(cè)定丁醇和木糖。

1.2.3 培養(yǎng)基的優(yōu)化 以丁醇產(chǎn)量為指標(biāo)，選擇木糖、酵母浸粉、維生素液、微量元素液為影響因素，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)4因素5水平共30個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選木糖發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的適宜培養(yǎng)基配比，研究因素間交互作用對(duì)丁醇產(chǎn)量的影響。用 Design Exprert軟件（Version 7.0，Stat-Ease.Inc.，Minneapolis，MN.USA.）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并描述響應(yīng)面。

表1 旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平及其編碼表

1.2.4 丁醇產(chǎn)量的測(cè)定 發(fā)酵液12000r/min離心10min，取上清液，與內(nèi)標(biāo)異丁醇混合后采用氣相色譜儀進(jìn)樣檢測(cè)。色譜柱為KB-5MS，25m×0.53mm× 1.00μm；檢測(cè)器FID；進(jìn)樣口溫度240℃；檢測(cè)器溫度260℃；柱溫80℃（保溫5min）～120℃（保溫3min）；載氣為N2，流速2.5mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 丁醇產(chǎn)量多元二次模型方程的建立及檢驗(yàn)

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定出影響丁醇產(chǎn)量的主要因素和添加量（表1），實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)點(diǎn)為30個(gè)，其中6個(gè)為檢驗(yàn)誤差的零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)值Y為丁醇產(chǎn)量。

利用Design expert軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到Cl.beijerinckii對(duì)木糖、酵母浸粉、維生素以及微量元素的二次多項(xiàng)式回歸方程為：

式中：Y1為丁醇產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值，X1、X2、X3、X4分別為木糖、酵母浸粉、維生素液和微量元素液的編碼值?；貧w方程的方差分析及模型可信度分析結(jié)果見表3。

由方程的方差分析結(jié)果（表3）可知，模型F值= 52.15827，概率（Pr＞F）值＜0.0001，非常顯著，失擬項(xiàng)在α=0.05水平上不顯著，表明模型擬合度很好。同時(shí)，一次項(xiàng)、平方項(xiàng)、交叉項(xiàng)均對(duì)響應(yīng)值有顯著性影響?；貧w方程確定系數(shù)R2=0.9736，說(shuō)明模型可以解釋97.36%實(shí)驗(yàn)所得丁醇產(chǎn)量的變化，表明模型與實(shí)際情況擬合較好。

表2 旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表3 丁醇產(chǎn)量二次多項(xiàng)模型及其各項(xiàng)的方差分析表

2.3 丁醇產(chǎn)量響應(yīng)面交互作用與優(yōu)化

由回歸方程作出響應(yīng)曲面圖（圖1～圖4）可較為直觀地反映出各因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。

圖中每個(gè)響應(yīng)面分別代表著兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用，此時(shí)第三個(gè)和第四個(gè)變量保持在最佳水平。由響應(yīng)面圖可知，木糖濃度和酵母浸粉濃度與丁醇產(chǎn)量存在極顯著的相關(guān)性，維生素液和微量元素液與丁醇產(chǎn)量也存在顯著的相關(guān)性。

圖1 木糖和酵母浸粉對(duì)丁醇產(chǎn)量影響的響應(yīng)面立體分析圖（維生素液=10mL/L，微量元素液=10mL/L）

圖2 木糖和維生素液對(duì)丁醇產(chǎn)量影響的響應(yīng)面立體分析圖（酵母浸粉=1g/L，微量元素液=10mL/L）

圖3 木糖和微量元素液對(duì)丁醇產(chǎn)量影響的響應(yīng)面立體分析圖（酵母浸粉=1g/L，維生素液=10mL/L）

圖4 酵母浸粉和維生素液對(duì)丁醇產(chǎn)量影響的響應(yīng)面立體分析圖（木糖=20g/L，微量元素液=10mL/L）

從圖1可以看出，木糖和酵母浸粉交互作用極顯著，當(dāng)木糖濃度在10～26.6g/L范圍內(nèi)時(shí)，隨著木糖濃度的增加，丁醇產(chǎn)量增加，但木糖濃度過(guò)高（大于26.6g/L），則會(huì)出現(xiàn)底物抑制作用使得丁醇產(chǎn)量下降；而酵母浸粉濃度增加時(shí)，丁醇產(chǎn)量先增加，然后有所下降，高濃度的酵母浸粉并不能促進(jìn)丁醇產(chǎn)量的增加，只有其濃度在1.25～1.5g/L時(shí)，才可獲得較高的丁醇產(chǎn)量。圖2顯示木糖和維生素液交互作用顯著，維生素液添加量在3～7mL/L時(shí)，丁醇產(chǎn)量隨木糖濃度的增加而顯著增加，當(dāng)添加量大于10mL/L時(shí)，丁醇產(chǎn)量增加不明顯。圖3表明，木糖和微量元素液交互作用不顯著，微量元素液添加量在9～11mL/L時(shí)，丁醇產(chǎn)量隨木糖濃度升高而有所增加，添加量大于11mL/L時(shí)，丁醇產(chǎn)量增加不明顯。由圖4可知，酵母浸粉和維生素液二者間也存在一定的交互作用，維生素液添加量在5～10mL/L時(shí)，丁醇產(chǎn)量隨酵母浸粉濃度升高而增大，添加量大于10mL/L時(shí)，丁醇產(chǎn)量增加不明顯。

通過(guò)對(duì)丁醇產(chǎn)量模型進(jìn)行求導(dǎo)和解逆矩陣，可以得到模型的極值點(diǎn)，木糖為26.6g/L，酵母浸粉1.38g/L，維生素液添加量5.55mL/L，微量元素液添加量9.67mL/L，此時(shí)模型預(yù)測(cè)的最大響應(yīng)值為6.61g/L。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行Cl.beijerinckii木糖發(fā)酵的培養(yǎng)基驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，分批次發(fā)酵（4次），丁醇產(chǎn)量平均值為6.69±0.42g/L，實(shí)驗(yàn)值與理論預(yù)測(cè)值非常接近，可見該模型可以較好地預(yù)測(cè)Cl.beijerinckii的實(shí)際發(fā)酵情況。

3 結(jié)論

可再生的木質(zhì)纖維類資源也可作為發(fā)酵丁醇的底物，從而可降低生物丁醇的原料成本。因此，有必要對(duì)Cl.beijerinckii的木糖發(fā)酵情況進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)通過(guò)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立了影響丁醇產(chǎn)量的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)該模型進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)，優(yōu)化了內(nèi)在因素水平，得出了木糖發(fā)酵制備生物丁醇的最佳培養(yǎng)基配方為木糖26.6g/L，酵母浸粉 1.38g/L，維生素液 5.55mL/L，微量元素液9.67mL/L。在最優(yōu)化條件下經(jīng)四次發(fā)酵培養(yǎng)基分批實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，預(yù)測(cè)值與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均值接近，與原始培養(yǎng)條件丁醇產(chǎn)量5.65g/L相比，丁醇產(chǎn)量提高了18.38%，達(dá)到6.69g/L。

［1］劉婭，劉宏娟，張建安，等.新型生物燃料——丁醇的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代化工，2008，28（6）：28-32.

［2］黃麗金，陸兆新，袁勇軍.響應(yīng)面法優(yōu)化德氏乳桿菌保加利亞亞種增殖培養(yǎng)基［J］.食品科學(xué)，2005，26（5）：103-107.

［3］王鐵男，韓建春.響應(yīng)面法優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)γ-多聚谷氨酸［J］.食品工業(yè)科技，2008，29（3）：177-179.

［4］潘春梅，樊耀亭，趙攀.發(fā)酵法產(chǎn)氫培養(yǎng)基的響應(yīng)面分析優(yōu)化［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（1）：38-44.

［5］Benoit Faucon BP，ABF and DuPont to Build Biofuel Plant.Wall Street Journal（Eastern edition）［N］.New York，2007-06-28（A9）.

［6］Ezeji TC，Qureshi N，，Blaschek，HP.Bioproduction of butanol from biomass：from genes to bioreactors［J］.Current Opinion in Biotechnology，2007，18：1-8.

［7］楊德著.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002.

Optimization of biobutanol production strain Costridiuml beijerinckii with xylose medium by response surface methodology

LIU Ya1，2，3，LIU Hong-juan2，ZHANG Jian-an2，*，CHEN Zong-dao1
（1.Food College，Southwest University，Chongqing 400716，China；2.Institute of Nuclear and New Energy Technology，Tsinghua University，Beijing 102201，China；3.Food College，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

Response surface method was used to optimize the fermentation medium of butanol production by Clostridiuml beijerinckii with xylose as the carbon resource.A regression equation was established and the optimal medium contained xylose 26.6g/L，yeast extract 1.38g/L，solution of vitamin 5.55mL/L and solution of mineral 9.67mL/L.Under this condition，the butanol concentration increased 18.4%than that of the control and the butanol concentration reached 6.69g/L.

Clostridium beijerinckii；xylose；biobutanol；medium；response surface methodology

TS201.3

A

1002-0306（2010）07-0194-03

2009-07-14 *通訊聯(lián)系人

劉婭（1974-），女，在讀博士，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)。