曾 婧，卓家珍，陳杖榴，孫永學(xué)

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）

洛克沙胂(Roxarsone，ROX)是近十幾年來被廣泛用作畜禽促生長的一種有機胂添加劑，經(jīng)畜禽攝入后大部分經(jīng)排泄物排出體外并進入周邊環(huán)境中.國外對畜禽糞便中總As含量及其代謝物的檢測已有報道［1-2］，結(jié)果表明排泄物中以ROX為主，亦檢測到的不同價態(tài)As.關(guān)于ROX原形的測定已有氮定法［3］、GC 法［4］和 HPLC 法［5-6］等，用于砷價態(tài)分析的分離方法有多種，其中以離子交換樹脂法最為常用［7-8］，原子熒光法(AFS)亦常用于總 As及無機As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的痕量測定.本文通過建立雞排泄物中ROX、總As及無機As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的分離與測定，旨在為研究洛克沙胂在雞飼喂后的排泄及消除規(guī)律提供檢測基礎(chǔ)，亦將為ROX在環(huán)境中的殘留與生態(tài)毒理學(xué)評估提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

洛克沙胂對照品，純度99.6%，批號20051214，由廣州惠華動物保健品公司提供;砷標準儲備液，含砷1000 mg/L，批號2070314，由國家標準物質(zhì)中心提供;三氧化二砷(As2O3)，純度≥99.9%，由Sigma公司提供;砷酸氫二鈉，純度≥99.9%，由BBL公司提供.其他化學(xué)試劑均為色譜純或分析純級.試驗用水為超純水.

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀，Agilent 1100型，美國Agilent公司生產(chǎn);雙道原子熒光光度計，AFS-9130型，北京吉天儀器有限公司生產(chǎn);微波消解系統(tǒng)，Ethos1型，意大利Milestone公司生產(chǎn);Straxa-X-AW型固相萃取小柱(3 mL)，美國Phenomenex公司生產(chǎn);717型強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂、732型強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，均由杭州市爭光樹脂有限公司提供.

1.3 標準試液配制

洛克沙胂儲備液:稱取洛克沙胂對照品100.0 mg于100 mL棕色容量瓶中，加適量流動相定容成1000 mg/L儲備液，4℃保存?zhèn)溆?砷標準使用液(1 μg/mL):由砷標準儲備液用φ=5%鹽酸溶液逐級配制而成.砷(Ⅲ)標準儲備液(1 mg/mL):稱取干燥As2O31.320 g溶于25 mL 200 g/L KOH溶液中，以H2SO4(φ=20%)定容至1000 mL搖勻;砷(Ⅴ)標準儲備液(1 mg/mL):稱取干燥砷酸氫二鈉1.650 g溶于純水中，用 H2SO4(φ=20%)定容至1000 mL搖勻.均用φ=5%鹽酸溶液逐級稀釋.

1.4 雞排泄物中洛克沙胂含量的測定

1.4.1 提取 取1.00 g空白雞糞于離心管中，依次添加10 μg/mL洛克沙胂標準溶液100 μL和10 mL提取液［V(0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液)∶V(甲醇)=90∶10］，震蕩提取30 min(60℃)，殘渣2次提取，合并上清液.加入100 g/L硫酸銅溶液2 mL，混勻靜置20 min，以8000 r/min離心5 min，過濾至25 mL容量瓶中，提取液定容，調(diào)pH至4.0～5.0，待凈化.

1.4.2 SPE凈化 將Straxa-X-AW小柱用3.0 mL甲醇活化和超純水平衡后，分2次加入5.0 mL提取液.依次用6.0 mL甲酸(φ=1%)淋洗和6.0 mL氨甲醇(φ=5%)洗脫洛克沙胂，負壓抽慮后洗脫液在60℃水浴吹干，加1.0 mL流動相溶解，經(jīng)0.22 μm針頭式過濾，濾液供檢測.

色譜條件為 Prsil BDS C18(5 μm，4.6 mm ×250 mm);紫外波長266 nm;流動相為V(0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液)∶V(甲醇)=90∶10，pH=2.5;進樣量為 20 μL.

1.4.3 標準曲線、回收率與變異系數(shù)的測定 取空白雞糞1.00 g于離心管中，加入100 μL洛克沙胂標準系列(5～500 μg/mL)，制得系列質(zhì)量比為0.5～50.0 μg/g，按上法處理與測定，由質(zhì)量比(C)與峰面積(S)求得標準曲線.在1.00 g空白糞樣中分別加入10、50 和 200 μg/mL 洛克沙胂溶液各 100 μL，制得質(zhì)量比為1.0、5.0和20.0 μg/g，重復(fù) 6次，計算回收率.以上3個制得質(zhì)量比各設(shè)6重復(fù)，共4批次，求批內(nèi)、批間變異系數(shù).

1.5 雞排泄物中總砷含量的測定

1.5.1 樣品處理 取0.50 g空白雞糞于微波消化罐內(nèi)，添加0.5 mL 1 μg/mL砷標準使用液、2 mL HNO3和0.5 mL H2O2，密封后設(shè)最佳消解條件消解.消解液經(jīng)水浴趕酸、還原、純水定容至25 mL后上AFS機檢測，設(shè)空白樣進行相對標準偏差(RSD)和檢測限(LOD)測定.由熒光強度(If)根據(jù)標準曲線方程求空白液和樣品中砷質(zhì)量濃度.AFS測定條件:載液為鹽酸(φ=5%)，還原劑為硼氫化鉀(20 mg/mL)，負高壓270 V，燈電流60 mA，載氣流量400 mL/min.

1.5.2 標準曲線、回收率和變異系數(shù)的測定 吸取1 μg/mL砷標準使用液2.5 mL于容量瓶中，加入1.25 mL濃鹽酸、2 mL還原劑，純水定容并自動稀釋測定 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L系列質(zhì)量濃度的熒光值制備標準曲線.取5份空白雞糞，測本底值和空白樣添加5個砷標準系列質(zhì)量濃度(10、20、40、60、80 μg/L)，各設(shè) 5 個重復(fù)，計算回收率和變異系數(shù).

1.6 雞排泄物中無機As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的分離測定

1.6.1 樣品提取 取1.00 g空白雞糞于15 mL離心管中，各添加0.1 mL As(Ⅴ)和As(Ⅲ)標準工作液(1.0 μg/mL，制得質(zhì)量比均為 0.1 μg/g)，加 10 mL提取液(0.6 mol/L磷酸二氫鉀溶液)，振蕩并離心，取上清液(重提2次)調(diào)pH至5.0，進行樹脂分離:提取液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾至陽離子樹脂中，振蕩后入陰離子交換樹脂柱(流速1.5 mL/min)，收濾液加入2.5 mL濃鹽酸，純水定容至50 mL，待測未吸附的As(Ⅲ);用20 mL 0.5 mol/L醋酸－醋酸銨緩沖液淋洗樹脂柱，棄解析液，用30 mL 0.2 mol/L鹽酸淋洗，收解析液，純水定容至50 mL，待測As(Ⅴ).均上AFS機檢測，同時設(shè)空白樣.

1.6.2 標準曲線、回收率和變異系數(shù)的測定 分別取1.0 μg/mL As(Ⅴ)、As(Ⅲ)標準溶液 0.1 mL 于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL濃鹽酸，純水定容，自動稀釋測定 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L系列質(zhì)量濃度的熒光值制備標準曲線.先取5份空白雞糞測得本底值后，空白添加As(Ⅴ)、As(Ⅲ)標準液(添加質(zhì)量比為0.05、0.50 和5.00 μg/g，5次重復(fù))測定.計算回收率和變異系數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 雞排泄物中洛克沙胂含量的測定

在空白糞樣中添加0.5～50.0 μg/g洛克沙胂系列質(zhì)量比，經(jīng)系列處理后進行HPLC測定可獲得較好的回收率和凈化效果，線性關(guān)系良好(r≥0.9994)，回收率為75.82% ～79.36%，批內(nèi)變異系數(shù)為2.75% ～5.71%，批間變異系數(shù)為4.22% ～5.11%，ROX能與排泄物中其他組分較好地分離，保留時間約7.6 min，表明本法精密度高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好.色譜圖見圖1、圖2.

圖1 雞空白糞的色譜圖Fig.1 Chromatograms of the bland excreta sample of chicken

圖2 雞空白糞添加標液(10.0 μg/mL)色譜圖Fig.2 Chromatograms of the bland excreta sample spiked with arsenic(10.0 μg/mL)

2.2 雞排泄物中總砷含量的測定

采用HNO3-H2O2(體積比4∶1)消解液可將樣品完全消解，呈澄清透明溶液.總砷質(zhì)量濃度在2～100 μg/L范圍內(nèi)線性良好(r＞0.999)，檢測限(LOD)為0.08 μg/L，回收率為94.69% ～109.17%，變異系數(shù)介于1.50% ～4.74%，符合檢測要求.

2.3 雞排泄物中無機As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的分離測定

As(Ⅲ)、As(Ⅴ)標準曲線在 0.5 ～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性良好(r＞0.999).在相同反應(yīng)條件下As(Ⅴ)、As(Ⅲ)熒光強弱不同，前者約為后者的1/3.As(Ⅴ)的 LOD 為 0.21.0 μg/L，As(Ⅲ)的 LOD為0.084 μg/L.As(Ⅲ)回收率為 87.8% ～113.0%，變異系數(shù)為1.90% ～5.39%;As(Ⅴ)回收率為81.1% ～127.3%，變異系數(shù)0.96% ～3.54%.均可滿足檢測要求.

3 討論

3.1 洛克沙胂原形的提取與凈化

對洛克沙胂的提取，所報道的方法不盡相同，常用超聲提取或水浴振蕩［5，9-10］.本試驗中對比了甲醇、0.05 mol/L磷酸氫二鉀－甲醇混合液、0.05 mol/L磷酸氫二鉀及20 g/L磷酸氫二鉀等4種提取液的提取效果，綜合比較干擾度、雜峰、用量及操作性等，最后選用0.05 mol/L磷酸氫二鉀－甲醇混合液按90∶10(體積比)2次提取，達到較好的效果.為克服雞糞中蛋白成分的干擾，通過比較了高氯酸、三氯乙酸、硫酸銅等，選用100 g/L硫酸銅溶液除蛋白效果為最佳.雞排泄物的成分復(fù)雜，為充分去除基質(zhì)的干擾，通過比較活性炭萃取小柱與弱陰離子柱Waters OasisRMAX［5］、強陰離子柱SAX與強陽離子柱SCX［11］等，以固相萃取小柱SAXj凈化效果為最佳.按以上篩選的處理方法，與AOAC(美國公職分析化學(xué)家協(xié)會)規(guī)定的標準方法一致.

3.2 微波消解條件的選擇及優(yōu)化

已有報道采用微波消解處理排泄物，進而測定砷含量［12］.本文比較了 HNO3、HNO3+(HClO4、HF或H2O2)4種消解體系及不同用量的效果，結(jié)果表明:2.5 mL 提取液［V(HNO3)∶V(H2O2)=4∶1］的效果最理想，利于趕酸、熒光值大、重現(xiàn)性好且消解完全呈清亮.

3.3 As(Ⅲ)、As(Ⅴ)提取條件的選擇

在各種形態(tài)砷中，無機砷毒性大于有機胂，又以無機As(Ⅲ)毒性最強.目前分離砷形態(tài)方法有GCMS、IC-AES、HPLC-HG-AFS、HPLC-ICP-MS 等［13-16］.離子交換樹脂價廉且操作簡單，多用于砷形態(tài)分析［17］.AFS法測定砷含量的方法成熟，故本文中先將砷幾種形態(tài)加以分離，再用AFS法可測得排泄物中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)含量.因 AFS只識別 As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA和MMA，需將它們分離并去除DMA、MMA干擾.DMA在酸性條件下可吸附在陽離子樹脂上，而MMA可吸附于陰離子樹脂，本試驗中通過先后采用陽、陰離子樹脂的吸附與洗脫從而去除干擾.

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