王利華 周 平 周 鵬 何 煒 李興華

肝臟原發(fā)性惡性腫瘤是最常見的惡性腫瘤之一,兔肝VX 2腫瘤模型是目前較成熟的應(yīng)用于肝癌臨床前期實驗的大型動物模型,在肝癌影像診斷學(xué)、抗癌藥物藥代動力學(xué)、腫瘤化療方法及介入治療學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[1,2]。超聲造影技術(shù)是近年來才發(fā)展起來的影像技術(shù),被譽為超聲醫(yī)學(xué)的第三次革命,可較好地應(yīng)用于腫瘤的血供評估[3,4]。本實驗旨在應(yīng)用超聲造影技術(shù)來檢測不同階段兔肝VX 2腫瘤的血供情況,以評估超聲造影在兔肝VX2腫瘤模型演變評估中的價值。

方 法

1.動物模型制作

新西蘭大白兔30只,體重2.0～2.5kg,平均2.28kg,雌雄不限,購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物學(xué)部。肝腫瘤模型制備過程如下:在無菌條件下手術(shù)剝離荷瘤兔肝VX 2實體瘤塊,生理鹽水沖洗,去除結(jié)締組織,選取腫瘤邊緣生長旺盛的魚肉樣組織,制成大小約1.0mm×1.0mm×1.0mm的瘤塊備用。兔術(shù)前禁食、禁水8h,3%戊巴比妥鈉(劑量30mg/kg)耳緣靜脈麻醉后固定在兔臺上,青霉素40萬U靜脈推注預(yù)防感染,備皮后常規(guī)消毒鋪巾。于兔上腹部劍突下作一正中縱行切口,長3.0cm左右,逐層進入腹腔暴露肝臟后,將兔肝左葉牽出體外,用眼科鑷夾取一腫瘤組織塊,將瘤塊植入肝實質(zhì)較厚處,然后將明膠海綿1～2塊(每塊大小約1.0mm×1.0mm×1.0mm)填塞并緊貼在肝表面?zhèn)谔?。確認無活動性出血后將肝臟放回腹腔,后逐層關(guān)腹。兔術(shù)后均給予青霉素40萬U肌注,待蘇醒后送回兔籠觀察。后每天給予青霉素8萬U肌注。

2.實驗動物分組及指標觀察

圖1 兔肝VX 2腫瘤超聲造影動脈相表現(xiàn)。A.為整體增強。B.為不均勻性增強。C.為周邊環(huán)狀增強。

將30只荷瘤兔隨機分成3組,每組10只,術(shù)后16天對第1組、術(shù)后28天對第2組、術(shù)后42天第3組荷瘤兔進行超聲檢查,每次檢查儀器設(shè)置條件一致。先用二維超聲掃查肝臟及腫瘤,選取腫瘤最大切面進入超聲造影模式,采用低機械指數(shù)狀態(tài)(M I≤0.12),調(diào)節(jié)合適參數(shù)(深度、聚焦、總增益、TGC等)并保持不變,經(jīng)耳緣靜脈團注0.1ml/kg SF6微泡懸浮液(按說明書配制)每次注射后立即尾隨注入1ml生理鹽水沖管,注射造影劑同時啟動超聲儀內(nèi)置計時器,實時不間斷觀察病灶的灌注及回聲強度變化,所有影像均存儲于主機硬盤內(nèi)。脫機處理圖片,于動脈相測量腫瘤的最大直徑,測量水平及垂直兩個方向上的直徑a、b,得最大直徑(a+b)/2。并由兩名CEUS臨床診斷經(jīng)驗豐富的高年資醫(yī)師分析造影劑灌注情況。

超聲造影后立即常規(guī)處死荷瘤兔,取肝臟腫瘤組織及周圍正常肝組織標本,選取腫瘤最大剖面測量最大直徑,方法同上,再行大體及顯微組織病理檢查。

3.統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析,超聲造影動脈相與大體標本測量腫瘤最大直徑的兩組數(shù)據(jù)進行配對t檢驗;超聲造影動脈相測得的三組腫瘤最大直徑以x±s差表示,進行q檢驗;計數(shù)資料進行R×C表資料的Chi-square檢驗,P＜0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.兔肝VX 2腫瘤模型的超聲造影檢查

超聲造影動脈相與大體標本測量腫瘤最大直徑的兩組數(shù)據(jù)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.10)。超聲造影動脈相測得三組兔肝VX 2腫瘤最大直徑:第1組(術(shù)后 16天):1.37±0.05cm,第2組 (術(shù)后 28天):2.02±0.09cm,第 3組(術(shù)后42天):2.39±0.12cm。三組數(shù)據(jù)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。30只荷瘤兔VX 2腫瘤超聲造影強化方式均呈 “快進快出”型,即在動脈相迅速增強,門脈相迅速廓清,低于周圍正常肝實質(zhì),類似于一般惡性腫瘤最常見的超聲造影表現(xiàn)。VX 2腫瘤在動脈相呈現(xiàn)三種增強模式(圖1):整體增強、不均勻性增強、周邊環(huán)狀增強,三組兔肝VX 2腫瘤在動脈相增強模式上存在差異 (P＜0.05)(表1)。其中第1組主要表現(xiàn)為整體增強(6/10),第2組主要表現(xiàn)為不均勻性增強(6/10),而第3組主要表現(xiàn)為周邊環(huán)狀增強(9/10)。

2.組織病理學(xué)檢查

2.1大體觀察(圖2):腫瘤呈類圓形,質(zhì)地較硬,無明顯包膜形成,切面呈灰白色魚肉狀。本實驗6個動脈相表現(xiàn)為整體增強的VX 2瘤結(jié)節(jié),病理結(jié)果顯示結(jié)節(jié)質(zhì)地較均勻,瘤內(nèi)無明顯壞死灶;10個動脈相表現(xiàn)為瘤內(nèi)不均勻性增強的VX 2瘤結(jié)節(jié),病理結(jié)果顯示瘤內(nèi)可見散在乳糜樣壞死灶;14個動脈相表現(xiàn)為瘤周環(huán)狀增強VX 2瘤結(jié)節(jié),病理結(jié)果顯示瘤結(jié)節(jié)中心形成單個囊腔壞死灶,腔內(nèi)為渾濁液體,部分為血性液體。

2.2H-E染色(圖3):VX 2腫瘤組織細胞在肝內(nèi)呈浸潤性癌巢,與肝實質(zhì)無明顯邊界,間質(zhì)分界不清,結(jié)締組織多少不等,癌巢邊緣見浸潤狀肝索結(jié)構(gòu);細胞呈不規(guī)則排列,瘤細胞體積大,形態(tài)不規(guī)則,胞質(zhì)豐富,淡紅染色,核肥大,其大小及形態(tài)各異,染色濃淡不均,核分裂像多見,間質(zhì)內(nèi)可見淋巴細胞、漿細胞浸潤。壞死組織呈大片紅染,其內(nèi)正常細胞結(jié)構(gòu)消失。

表1 兔肝VX 2腫瘤模型超聲造影動脈相的增強模式(例)

討 論

VX 2細胞株起源于Shope病毒誘發(fā)的兔乳頭狀瘤衍生的鱗癌,經(jīng)過72次移植傳代后建立了細胞株VX 2,它可接種于兔的肝臟、腎臟、肌肉等組織器官內(nèi)制成原位腫瘤動物模型[5,6]。兔肝VX 2腫瘤模型一般可分為三個生長時期[7]:①實質(zhì)期(種植后2～3周):大量腫瘤血管生成,在VX 2瘤周邊形成大量粗細不均、雜亂的供瘤血管,并有穿支血管伸入腫瘤內(nèi)部;②壞死期(4～5周):腫瘤血管生成趨于穩(wěn)定,瘤體生長快于血管生成,腫瘤中央因缺血而出現(xiàn)壞死;③囊變期(6～7周):腫瘤血管退化,瘤中央大片液化形成囊腔。由于兔肝VX 2腫瘤血供特點及生長特性類似人類肝細胞肝癌,常被用于肝腫瘤影像診斷學(xué)、抗癌藥物藥代動力學(xué)、化療及介入治療學(xué)等方面的基礎(chǔ)研究。

超聲造影為血池造影,采用可進入組織微循環(huán)的造影劑和低機械指數(shù)連續(xù)成像方法,能夠?qū)崟r動態(tài)地觀測實質(zhì)組織的微血管結(jié)構(gòu),反映病變組織的血流灌注情況。本實驗兔肝VX 2腫瘤超聲造影呈現(xiàn)“快進快出”型強化方式?？赡苁且驗?兔肝VX 2腫瘤的血供主要來自肝動脈[8],供養(yǎng)VX 2腫瘤的肝動脈血管內(nèi)造影劑較靜脈內(nèi)的造影劑少,經(jīng)過一次微循環(huán)而先到達腫瘤組織,因此形成腫瘤血管動脈相迅速增強的影像。肝實質(zhì)主要由門靜脈供血,在門靜脈灌注后肝實質(zhì)開始明顯增強,而瘤體內(nèi)因缺乏門靜脈滋養(yǎng)并且腫瘤新生血管發(fā)育多不成熟,由肝動脈來的造影劑可以通過“短路”途徑快速廓清而顯示負性低增強區(qū),呈現(xiàn)“快出”現(xiàn)象,從而使腫瘤與正常肝實質(zhì)形成明顯回聲“缺失”的影像反差,即呈現(xiàn)“快進快出”型強化方式。

兔肝VX 2腫瘤在二維超聲上呈等回聲、低回聲或稍高回聲,其中以等回聲多見,與周圍正常肝實質(zhì)灰階對比不明顯,腫瘤邊界顯示欠清晰,故在測量上會有較大誤差。本組采用超聲造影對30個兔肝VX 2腫瘤進行了測量,發(fā)現(xiàn)測量結(jié)果與病理結(jié)果相似,與文獻報道一致[9,10]。說明超聲造影在兔肝VX 2腫瘤測量方面有明顯的優(yōu)勢,這主要是因為在動脈相造影劑迅速充填腫瘤血管,呈“燈泡征”,腫瘤與周圍肝組織灰階對比明顯增強,從而可清晰顯示腫瘤及其邊界,有利于準確進行測量。本組采用超聲造影還對不同階段組的兔肝VX 2腫瘤進行測量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)第3組大于第2組,第2組大于第1組(P＜0.05),說明隨著時間的推移,兔肝VX 2腫瘤呈逐漸增大趨勢。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)30個兔肝VX 2腫瘤,有6個VX 2瘤結(jié)節(jié)表現(xiàn)為動脈相整體增強,病理結(jié)果顯示瘤內(nèi)無明顯壞死灶;24個VX 2瘤結(jié)節(jié)表現(xiàn)為動脈相瘤內(nèi)不均勻性增強或周邊環(huán)狀增強,與病理結(jié)果顯示的壞死范圍一致,說明我們可以根據(jù)腫瘤在動脈相的增強模式來準確判斷腫瘤的血供狀態(tài)及壞死范圍。

本實驗對處于不同生長階段的兔肝VX 2腫瘤在動脈相增強模式進行了研究,發(fā)現(xiàn):實質(zhì)期(第1組)主要呈整體增強(6/10),壞死期(第2組)主要呈不均勻性增強(6/10),囊變期(第3組)主要呈周邊環(huán)形增強(9/10)?？赡艿脑?兔肝VX 2腫瘤早期腫瘤細胞即開始釋放各種血管新生因子,腫瘤新血管開始生成,逐漸形成以動脈為基礎(chǔ)的腫瘤滋養(yǎng)血管網(wǎng),隨著腫瘤的增長,瘤周及瘤內(nèi)血流逐漸豐富。當腫瘤直徑超過2mm時,毛細血管大量形成,血管增多、增粗,大約在2～3周(實質(zhì)期)瘤灶新生血管生長最旺盛,故此期的兔VX 2肝腫瘤在動脈相主要表現(xiàn)為整體增強。此后由于瘤體增長快于血管增生,瘤中心部因缺血而形成壞死灶,VX 2瘤進入壞死期(4～5周),此時動脈相主要呈不均勻增強(壞死灶無增強,腫瘤組織迅速增強)。6～7周(囊變期)瘤體血管增生明顯減緩,血管退化,瘤體因缺乏血供而大部分壞死,呈大片液化壞死灶并形成囊腔,僅存瘤周少量環(huán)狀血管。故此時動脈相主要表現(xiàn)為周邊環(huán)狀增強,本實驗中第1組有4只荷瘤兔腫瘤超聲造影表現(xiàn)為不均勻性增強或周邊環(huán)狀增強,說明瘤內(nèi)出現(xiàn)了壞死灶,提前進入了壞死期;第2組有4只荷瘤兔腫瘤超聲造影表現(xiàn)為周邊環(huán)狀增強。說明壞死范圍較大,提前進入了囊變期;而第3組有1只荷瘤兔瘤灶呈不均性增強,說明瘤灶生長緩慢,尚處于壞死期。這可能是由于荷瘤兔存在個體差異的緣故。

綜上所述,超聲造影可準確測量出兔肝VX 2腫瘤直徑及變化趨勢,即隨著時間的推移,腫瘤呈逐漸增大的趨勢;可根據(jù)腫瘤在動脈相的增強模式來準確判斷腫瘤的血供狀態(tài)及壞死范圍。超聲造影能較好地評估兔肝VX 2腫瘤的演變過程,為兔肝VX 2腫瘤模型實驗研究提供依據(jù)。