吳青蕓 萬靈書 徐志康

(浙江大學(xué)高分子科學(xué)與工程學(xué)系高分子合成與功能構(gòu)造教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江杭州 310027)

聚丙烯腈分離膜表面的酶固定化研究進(jìn)展＊

吳青蕓 萬靈書 徐志康＊＊

(浙江大學(xué)高分子科學(xué)與工程學(xué)系高分子合成與功能構(gòu)造教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江杭州 310027)

總結(jié)了近 30年來圍繞聚丙烯腈分離膜表面酶固定化的實(shí)現(xiàn)、酶活性的保持及其應(yīng)用研究等相關(guān)問題的進(jìn)展,并對今后的發(fā)展前景予以展望。

酶作為一種生物催化劑,與其他無機(jī)或有機(jī)催化劑相比,具有催化效率高、專一性強(qiáng)、作用條件溫和、反應(yīng)控制容易等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于合成化學(xué)、食品工程、環(huán)境治理等領(lǐng)域以及生物反應(yīng)器和生物傳感器等高新技術(shù)。但是自由酶在實(shí)際應(yīng)用中存在許多局限,如:對溫度、pH和無機(jī)離子等外界因素的穩(wěn)定性較差,難于從底物和產(chǎn)物中回收而限制了酶的連續(xù)化反應(yīng),產(chǎn)物需要進(jìn)一步分離純化而增加了生產(chǎn)成本等。為克服這些限制,固定化酶技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。將酶固定于載體上不僅能有效地解決分離和回收利用的問題,而且對提高酶的穩(wěn)定性、利用率和使用壽命具有重要意義。目前,用于固定酶的載體有多種,其中分離膜材料表面的酶固定化有機(jī)結(jié)合了膜的分離作用和酶的生物催化功能,從而受到人們的青睞。自 1968年Michaels[1]首次提出酶-膜生物反應(yīng)器 (enzyme-membrane bioreactor)的概念以來,酶-膜反應(yīng)器已被廣泛應(yīng)用于有機(jī)相酶催化、手性拆分與合成、生物大分子分解等多個方面。而酶-膜生物傳感器的設(shè)計(jì)和研究更進(jìn)一步拓寬了固定化酶膜的應(yīng)用前景。

聚丙烯腈(PAN)具有易成膜、機(jī)械強(qiáng)度高、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),是較早被用于工業(yè)化生產(chǎn)的聚合物分離膜材料之一。此外,丙烯腈單體能與多種烯類單體共聚,其中的腈基也可方便地實(shí)施化學(xué)反應(yīng),這些都為聚丙烯腈膜材料的改性提供了有利的條件。聚丙烯腈分離膜根據(jù)其形態(tài)可分為平板膜、中空纖維膜和納米纖維膜。其中,平板膜和中空纖維膜主要采用浸沒沉淀相轉(zhuǎn)化法制備,常選用二甲基亞砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等為溶劑。而近年來重新引起關(guān)注的靜電紡絲被應(yīng)用于聚丙烯腈納米纖維膜的制備,拓展了聚丙烯腈分離膜的研究和應(yīng)用。20世紀(jì) 90年代,Godjevargova等人[2]首次報道了聚丙烯腈超濾膜用于葡萄糖氧化酶的固定化,翻開了聚丙烯腈分離膜表面酶固定化研究的新篇章。隨后,人們圍繞膜表面酶固定化的實(shí)現(xiàn)、酶催化活性和穩(wěn)定性的提高以及固定化酶膜的應(yīng)用等相關(guān)課題展開了深入的探討。

1 聚丙烯腈分離膜表面酶固定化的實(shí)現(xiàn)

物理法是膜表面酶固定化最簡單直接的方法,主要包括吸附法、凝膠化法、包埋法等[3]。它們不涉及化學(xué)反應(yīng),操作方便,固定化過程溫和,酶活性回收率高,但酶與載體的結(jié)合力較弱,易受外界因素影響而脫落。Shan等[4]發(fā)展了一種電化學(xué)包埋法,利用葡萄糖氧化酶在電場作用下隨電荷躍遷被包埋到丙烯腈-丙烯酸共聚物多孔膜載體中,不僅提高了酶活保留率,同時兼顧了酶與載體的固定化牢固程度。這種新型的葡萄糖氧化酶電極具有高靈敏度、低檢測限、良好穩(wěn)定性等特點(diǎn),對于研制高性能的生物傳感器有著重要的指導(dǎo)意義。

相對于物理固定法,共價結(jié)合法和交聯(lián)法等化學(xué)方法具有結(jié)合牢固、抗外界干擾能力強(qiáng)、酶不易脫落等特點(diǎn)[5]。聚丙烯腈膜表面固定酶通常采用共價結(jié)合法,即利用酶與膜表面的反應(yīng)基團(tuán)形成共價鍵,從而將酶固定化。Godjevargova等[6]利用共價結(jié)合法將葡糖糖氧化酶固定在丙烯腈共聚物膜表面,得到了較離子鍵合法更高的載酶量、酶活性和穩(wěn)定性。眾所周知,酶蛋白主要由氨基酸組成,且?guī)в锌尚纬晒矁r鍵的多種化學(xué)基團(tuán),如氨基、羧基、巰基、羥基、酚基、咪唑基等。因此,如何將合適的反應(yīng)基團(tuán)引入到膜表面,有效地與酶蛋白進(jìn)行共價結(jié)合,是聚丙烯腈膜材料設(shè)計(jì)中的首要問題。最直接的方法是表面處理法,即選用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑處理聚丙烯腈分離膜,將腈基轉(zhuǎn)化成其他易反應(yīng)的基團(tuán)。氫氧化鈉 (NaOH)水溶液是常見的處理劑,它可將腈基水解成羧基或氨基等 (圖 1)。Li等[7]用乙醇和氯化氫氣體活化腈基,實(shí)現(xiàn)了脂肪酶在聚丙烯腈納米纖維膜上的固定化。然而,由于表面處理法所形成的反應(yīng)基團(tuán)數(shù)量有限,可控性差,而且處理過程容易破壞膜結(jié)構(gòu),因而該法的推廣應(yīng)用有待商討。

圖1 氫氧化鈉(NaOH)和乙二胺(H2N(CH2)2NH2)處理聚丙烯腈生成氨基的過程

共聚合是聚丙烯腈分離膜表面基團(tuán)設(shè)計(jì)的有效方法。丙烯腈容易與不同烯類單體共聚,從而引入不同的反應(yīng)性基團(tuán),其共聚物成膜后可用于多種酶的共價固定。表 1列舉了近年來文獻(xiàn)報道的共聚單體、酶種類、固定化方法以及膜結(jié)構(gòu)類型等相關(guān)信息。Godjevargova課題組開展了較為系統(tǒng)的工作[6,8-9],他們以丙烯腈-甲基丙烯酸縮水甘油酯、丙烯腈-N-乙烯基咪唑、丙烯腈-甲基丙烯酸甲酯-乙烯基磺酸鈉等多種共聚物制成的超濾膜為載體,用于固定葡萄糖氧化酶、尿素酶、過氧化氫酶等,探討了載酶量、酶活性、穩(wěn)定性等性能。

在共聚合的基礎(chǔ)上,輔以表面處理法,可進(jìn)一步增加膜表面固定酶的反應(yīng)基團(tuán)數(shù),甚至提高膜的親水性[2],改善傳質(zhì)特性[10]。Godjevargova等[2]比較了羥胺 (HA)、六亞甲基二胺(HMDA)、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEMA)、二鹽酸肼(HDC)等多種化學(xué)試劑對丙烯腈共聚物膜改性后的酶固定化效果,發(fā)現(xiàn)隨著改性膜(除 HDC外)的親水性和氨基數(shù)量增加,酶活性隨之提高。此外,他們用 7種不同的化學(xué)方法對丙烯腈-甲基丙烯酸甲酯-乙烯基磺酸鈉共聚物進(jìn)行改性[11],并通過化學(xué)法將脲酶固定化于改性后的膜表面。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用硫酸氫銨改性后膜表面固定化酶的相對活性最高(68%)。

表1 常見丙烯腈共聚物膜及其酶的固定化

2 固定化酶活性的保持

酶活性的保持是固定化酶研究的重點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn),盡管固定化后酶的穩(wěn)定性提高,但酶的活性在多數(shù)情況下低于自由酶,這種動力學(xué)行為變化與酶結(jié)構(gòu)的改變、位阻效應(yīng)、分配效應(yīng)和擴(kuò)散效應(yīng)有關(guān)[5]。就膜表面的酶固定化而言,膜孔形態(tài)和尺寸不僅決定底物分子的擴(kuò)散速率,而且直接影響到酶的活性中心對底物分子的定位作用,使酶催化作用受到限制;膜的表面性質(zhì)則關(guān)系到酶構(gòu)象的保持和酶催化作用的發(fā)揮;為特殊酶類提供相應(yīng)的機(jī)制可以輔助和加強(qiáng)催化過程的實(shí)現(xiàn)。因此,設(shè)計(jì)合理的膜形態(tài)、構(gòu)建具有良好性質(zhì)的膜表面、建立外援機(jī)制等對固定化酶活性的保持具有十分重要的意義。

2.1 膜形態(tài)

在聚丙烯腈分離膜表面的酶固定化研究中,超濾膜是最常用的載體形式(表 1)。然而,由于超濾膜的表面孔隙率低、孔徑小,限制了膜表面的載酶量,導(dǎo)致傳質(zhì)阻力增大,而且易對酶與底物分子的結(jié)合造成立體障礙。近年來興起的聚丙烯腈納米纖維膜可以有效地克服上述不足,它不僅制備簡單,更重要的是具有很高的比表面積,可以承載更多酶,而且這種特殊的表面結(jié)構(gòu)有利于酶催化功能的發(fā)揮[19]。

作者所在的課題組[12-13,20-24]利用丙烯腈-馬來酸共聚物 (PANCMA)優(yōu)良的成膜、成纖性質(zhì),采用靜電紡絲法制備其納米纖維膜,并用于脂肪酶的固定化。研究表明[22],PANCMA納米纖維膜表面的脂肪酶固定量((21.2±0.71)mg/g)和保留活性 ((37.6±1.8)%),均大于相應(yīng)的中空纖維膜 ((2.36±0.06)mg/g,(33.9±1.6)%),而且載酶量隨纖維直徑的減小而增加。粗略比較發(fā)現(xiàn),該兩項(xiàng)指標(biāo)也明顯優(yōu)于 Godjevargova等人[6]在超濾膜表面的酶固定化結(jié)果。

2.2 膜表面性質(zhì)

分離膜表面是酶固定化的主要場所,其表面性質(zhì)與穩(wěn)定酶構(gòu)象、保持酶活性息息相關(guān)。一般認(rèn)為,具有良好生物相容性的表面可以減弱酶蛋白與膜之間的非生物特異性相互作用,并創(chuàng)造更適宜的微環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn),在膜表面構(gòu)建良好的仿生微環(huán)境,有利于穩(wěn)定酶的構(gòu)象和保留酶的活性。將具有良好生物相容性的生物大分子固定在膜表面是實(shí)現(xiàn)仿生改性的有效方法,常用的生物大分子有殼聚糖[20,23-25]、磷脂[26-27]、明膠[20-21]等。

殼聚糖是甲殼素脫乙?；蟮难苌?來源廣、成本低。作為一種天然的多糖,殼聚糖具有不同于其他生物大分子的優(yōu)良特性,如化學(xué)穩(wěn)定性高、親和性好、生物毒性小等。尤其是殼聚糖分子中存在大量氨基,可以通過共價結(jié)合的方法穩(wěn)定地固定在聚丙烯腈膜的表面,形成一種良好的酶固定化載體。葉鵬等[20,23-24]較系統(tǒng)地研究了殼聚糖修飾丙烯腈共聚物膜表面的脂肪酶固定化,通過 EDC/NHS活化,將殼聚糖共價結(jié)合在丙烯腈-丙烯酸共聚物中空纖維膜表面,然后用戊二醛法固定脂肪酶 (圖 2)。研究結(jié)果表明,經(jīng)殼聚糖改性后,膜表面的載酶量(66.5mg/m2)、保留活性(44.5%)和耐熱性能等均得到明顯提高。用相同的方法分別對丙烯腈-馬來酸共聚物納米纖維膜和中空纖維膜進(jìn)行改性,得到了類似的結(jié)果。Gabrovska等[28]研究了不同殼聚糖改性方法對聚丙烯腈膜表面酶固定化效果的影響,發(fā)現(xiàn)化學(xué)共價結(jié)合法更有利于提高固定化酶的熱穩(wěn)定性。

圖2 殼聚糖修飾丙烯腈共聚物膜表面的脂肪酶固定化過程[23]

磷脂是另一種常用的生物分子,將其用于膜表面改性可以消除固定化酶三維構(gòu)象的改變,同時顯著降低疏水相互作用引起的物理吸附[29]。黃小軍等[26-27]通過共聚反應(yīng)將磷脂基團(tuán)引入聚丙烯腈主鏈,經(jīng)靜電紡絲制備納米纖維膜,用于脂肪酶的固定化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶活性顯著提高。這主要是由于磷脂基團(tuán)構(gòu)建了一個親水、生物相容和穩(wěn)定的仿生微環(huán)境,而且有效地活化了脂肪酶。

明膠是一種無脂肪的蛋白質(zhì),是膠原的水解產(chǎn)物。葉鵬等[20]將殼聚糖和明膠用碳二亞胺法分別引入到丙烯腈-馬來酸共聚物納米纖維膜的表面,用戊二醛法將脂肪酶固定于殼聚糖和明膠修飾的膜材料表面,分別研究了殼聚糖和明膠修飾對固定化脂肪酶活性、載酶量、反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)和穩(wěn)定性的影響。結(jié)果顯示,固定化酶的保留活性、載酶量和熱穩(wěn)定性都較高,其中殼聚糖修飾膜為 45.6%、(22.5±0.75)mg/g和 66%,明膠修飾膜為 49.7%、(20.7±0.75)mg/g和 62%。

除此之外,生物大分子在膜表面的存在形態(tài)、覆蓋量和本征性質(zhì)都會影響固定化酶的最終性能。王振剛等[30]分別用牛血清白蛋白 (BSA)和膠原 (collagen)改性丙烯腈-丙烯酸共聚物(PANCAA)納米纖維膜,然后用于固定過氧化氫酶 (catalase)。研究發(fā)現(xiàn),過氧化氫酶的活性和載酶量依賴于BSA和膠原在膜表面的覆蓋率、形態(tài)和固定方法 (如圖 3所示)。由于膠原為纖維狀結(jié)構(gòu),能較好地覆蓋纖維膜表面,因此載酶量隨膠原濃度的變化較小;而 BSA為心形結(jié)構(gòu),在膜表面的覆蓋密度隨 BSA濃度增加而增加,由此影響載酶量的變化。另外,戊二醛(GA)作為偶聯(lián)劑,只能與酶蛋白分子的氨基共價結(jié)合,而不與膜表面的羧基作用,因而能有效消除酶與膜表面的直接作用,從而穩(wěn)定酶的活性。

圖3 PANCAA納米纖維膜表面固定過氧化氫酶的示意圖

2.3 電子傳輸性質(zhì)

對于特殊的酶類,除膜形態(tài)和表面性質(zhì)外,給予一定的輔助機(jī)制有助于酶催化功能的體現(xiàn)。氧化還原酶是一類促進(jìn)作用物氧化和還原的酶類,主要有乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶等。這類酶的催化過程涉及電子轉(zhuǎn)移,因而要求載體具備一定的電子傳輸能力或建立電子傳輸通道。對于非導(dǎo)電高分子,摻雜具有導(dǎo)電功能的無機(jī)納米粒子可以實(shí)現(xiàn)導(dǎo)電通路的建立,碳納米管尤為常見[31]。

王振剛等[32-33]將 PANCAA與多壁碳納米管(MWCNTs)復(fù)合制備納米纖維膜,不僅提高了過氧化氫酶的載酶量,而且當(dāng)MWCNTs的摻雜量為 30%時,酶活性提高 42.9%。這種顯著提高被認(rèn)為是MWCNTs在過氧化氫酶催化過程中發(fā)揮著電子給體和受體的作用,促進(jìn)了電子的轉(zhuǎn)移,其可能的機(jī)理如圖4所示。萬靈書等[34]進(jìn)一步研究了卟啉復(fù)合對 PANCAA納米纖維膜固定化酶的改性效果,結(jié)果表明當(dāng)卟啉和MWCNTs同時與 PANCAA復(fù)合時,過氧化氫酶活性提高幅度可達(dá) 49.5%。

圖4 PANCAA/MWCNTs納米纖維表面過氧化氫酶催化反應(yīng)的電子轉(zhuǎn)移示意圖[32]

除碳納米管外,金納米顆粒是一種理想的納米材料。一方面,它具有良好的生物相容性,常被用作酶、抗體、DNA的載體;另一方面,它具有優(yōu)良的導(dǎo)電性,可作為酶催化的電子轉(zhuǎn)移橋梁。Marinov等[35]在設(shè)計(jì)乙酰膽堿酶傳感器時,將金納米顆粒與丙烯腈共聚物膜復(fù)合,提高了傳感器的響應(yīng)性。

3 聚丙烯腈分離膜表面固定化酶的應(yīng)用

酶-膜反應(yīng)器和酶-膜生物傳感器是固定化酶膜的兩個重要的應(yīng)用領(lǐng)域。酶-膜反應(yīng)器結(jié)合了酶的生物催化功能和膜的分離作用,使催化反應(yīng)和產(chǎn)物分離同時進(jìn)行,加速反應(yīng),提高轉(zhuǎn)化率。而酶-膜生物傳感器利用信號轉(zhuǎn)換器將酶生物催化信息轉(zhuǎn)化成可測量的光、電等信號,用于檢測樣品的組成。對于聚丙烯腈分離膜表面的固定化酶而言,目前已有學(xué)者在酶-膜反應(yīng)器和膜生物反應(yīng)器方面進(jìn)行探索嘗試[14,16,36-37]。黃小軍等[14]將脂肪酶固定于丙烯腈-甲基丙烯酸 2-羥乙酯共聚物(PANCHEMA)納米纖維膜并制成酶-膜反應(yīng)器,嘗試了其在硝基苯棕櫚酸酯水解方面的應(yīng)用。對于固定的載酶量和反應(yīng)條件,當(dāng)?shù)孜锪魉購?.2mL/min提高至2mL/min時,轉(zhuǎn)化率由 3.6%降至 1.8%。Li等[37]以脂肪酶固定化聚丙烯腈納米纖維膜為反應(yīng)器,在大豆油水解的最佳條件下,反應(yīng) 1.5h后其轉(zhuǎn)化率可達(dá)到 85%。除脂肪酶外,Vasileva等[16]還探討了固定化辣根過氧化氫酶在苯酚水解方面的應(yīng)用。

4 結(jié)束語

近 30年來,人們在聚丙烯腈分離膜的設(shè)計(jì)制備、多種酶的固定化、以及酶活性和穩(wěn)定性的提高方面取得了顯著進(jìn)展,并逐漸在酶-膜生物反應(yīng)器和傳感器的設(shè)計(jì)試驗(yàn)方面開展相關(guān)工作。聚丙烯腈分離膜表面的酶固定化研究還將繼續(xù)向高活性、高穩(wěn)定性、多樣性等方面發(fā)展,最終實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。

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國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃資助課題(2007AA10Z301)

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