張雪雁 李琳琳

維吾爾族血糖異常人群腸道菌群ERIC-PCR指紋圖譜分析

張雪雁 李琳琳

目的:應用ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)，以新疆地區(qū)維吾爾族人群腸道菌群為研究對象，初步探討血糖不同人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)特征以及與2型糖尿病的關(guān)系。方法:以不同血糖人群的糞便為樣本，直接提取細菌總DNA，以此為模板進行ERIC-PCR擴增，得到反映腸道菌群結(jié)構(gòu)特征的DNA指紋圖譜，并進行比較分析。結(jié)果:正常空腹血糖人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)有一定差異，但它們卻有著共同的結(jié)構(gòu)特征；正常空腹血糖人群與2型糖尿病人群和糖耐量減低人群間的腸道菌群結(jié)構(gòu)差異較大。結(jié)論:通過分析比較指紋圖譜的差異，提示維吾爾族人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)很有可能與2型糖尿病有一定的關(guān)系。

2型糖尿??；菌群結(jié)構(gòu)；ERIC-PCR；DNA指紋圖譜

人類腸道定植著一個十分復雜而又相對穩(wěn)定的微生物區(qū)系，這個區(qū)系棲息的細菌大約有400多種，數(shù)量達1014左右［1］，形成一個極其復雜的微生態(tài)系統(tǒng)。這些固有的腸道細菌含有種類繁多的酶系統(tǒng)，參與宿主能量、物質(zhì)及遺傳信息轉(zhuǎn)運等一系列生理過程[2－4]。

通過對新疆部分地區(qū)2型糖尿病進行流行病學調(diào)查研究，結(jié)果顯示:新疆維吾爾族2型糖尿病的患病率較高，約為14%。醫(yī)學研究表明，在高蛋白多肉食與高纖維飲食地區(qū)生活的人群相比較，兩種人群的糞便中細菌種類與數(shù)量有顯著的區(qū)別?；诰S吾爾族的飲食結(jié)構(gòu)特點及生活環(huán)境特點，提示其腸道菌群的種類與數(shù)量具有一定的特征，這可能與2型糖尿病的發(fā)生有關(guān)。

本文以維吾爾族正?？崭寡墙M人群、糖耐量減低組人群和2型糖尿病人群為研究對象，直接從糞便中提取細菌總基因組DNA，用ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)，對腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征進行分析，比較三組人群的腸道菌群的種類數(shù)量和種群的差異，以求找到腸道內(nèi)與健康及2型糖尿病有重要關(guān)系的菌群及結(jié)構(gòu)特點，初步探討維吾爾族2型糖尿病患病率較高的原因，尋找最佳的治療方案。

1 材料

1.1 樣品收集 根據(jù)WHO公布的糖尿病診斷標準，篩選了40例正?？崭寡钦吆?1例2型糖尿病患者。所用糞便樣品收集后立即在－20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 裂解液I:NaCl、Na2EDTA，pH8.0；裂解液II:NaCl、Tris-HCl，pH8.0。SDS、RNA酶、溶菌酶、蛋白酶K、Taq酶等均購自上海生工生物工程公司。

2 方法

2.1 樣品前處理 稱取1g樣品，用無菌PBS溶液渦旋混勻后低速離心，收集上清。重復三次。然后5000r/min離心上清，收集沉淀后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細菌總DNA的提取 取處理好的樣品，依次加入裂解液I和溶菌酶，輕輕混勻10min后，冰浴70min；加入裂解液II、10%SDS，輕輕混勻加入蛋白酶K，混勻10min后37℃水浴過夜；分別加入等體積Tris-HCl飽和酚、飽和酚和氯仿異戊醇、氯仿抽提；加入無水乙醇沉淀過夜后，高速離心30min留沉淀，干燥后溶于TE中，加入RNA酶37℃水浴消化后－20℃冷凍備用。

2.3 ERIC－PCR 參照文獻[9]，利用引物ERIC-1和ERIC-2進行擴增，反應條件:95℃預變性7min、經(jīng)30個循環(huán)（94℃1min、52℃1min、65℃8min），最后65℃延伸16min。

2.4 檢測 取擴增產(chǎn)物8μl經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，進行檢測。

2.5 指紋圖譜分析 采用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果

3.1 正?？崭寡墙M人群的ERICPCR電泳檢測結(jié)果

圖1 和圖2顯示，不同個體的ERICPCR指紋圖譜雖存在有差異，但它們在800bp～900bp、1200bp～1500bp之間有明亮整齊的條帶存在。

圖1 正?？崭寡墙M人群ERIC-PCR電泳檢測結(jié)果

圖2 正?？崭寡墙M人群ERIC-PCR電泳檢測結(jié)果

3.2 正?？崭寡墙M、糖耐量減低組和2型糖尿病組人群間腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異

3.2.1 三組人群ERIC-PCR電泳檢測結(jié)果

圖3 和圖4顯示，正常空腹血糖組人群的ERIC-PCR指紋圖譜在800bp～900bp、1200bp～1500bp之間有較明亮整齊的條帶存在，而2型糖尿病組和糖耐量減低組則條帶亮度弱或無條帶存在。

圖3 正?？崭寡墙M人群和2型糖尿病組人群的ERIC-PCR電泳檢測結(jié)果

圖4 2型糖尿病組人群和糖耐量減低組的ERIC-PCR電泳檢測結(jié)果

3.2.2 三組人群的ERIC-PCR指紋圖譜在800～900bp、1200～1500bp條帶檢出率

表1、2顯示，正?？崭寡墙M與糖耐量減低組(IGT)、2型糖尿病組(T2DM)之間具有顯著性差異。

4 討論

E R I C是腸桿菌基因間重復共有序列，具有一定的保守性，定位在基因組中可轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)或與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的區(qū)域內(nèi)[5]。由于ERIC重復序列分布的位置及拷貝數(shù)在不同細菌中均不相同，通過擴增，這種差異可以反映在ERIC-PCR指紋圖譜中[6-9]。本文利用ERIC-PCR電泳指紋圖譜技術(shù)對維吾爾族正?？崭寡墙M、IGT組和T2DM組人群間腸道菌群結(jié)構(gòu)特征進行比較和分析。實驗結(jié)果顯示，40例正?？崭寡墙M人群中，在800bp～900bp、1200bp～1500bp之間有明亮整齊的條帶存在的檢出率分別為72.50%、67.50%；14例IGT和T2DM組人群中，檢出率分別為21.43%、14.29%。由此可以推斷在正?？崭寡墙M人群中普遍存在的800bp～900bp、1200bp～1500bp之間的DNA片段所代表的細菌很可能與血糖有關(guān)。IGT和T2DM組人群的腸道菌群在800bp～900bp、1200bp～1500bp之間的條帶信號缺失或很弱，說明IGT和T2DM組人群的腸道菌群失衡，發(fā)生血糖升高很有可能與這些DNA片段所代表的細菌缺失有關(guān)。

根據(jù)ERIC-PCR指紋圖譜提供的線索，很有希望找到一些與血糖相關(guān)的DNA片段，然后將這些DNA片段克隆測序，找到來源的細菌，看是否可以通過調(diào)整腸道菌群，找到維吾爾族2型糖尿病患病率水平高的原因，為尋找最佳的治療方案提供依據(jù)，這對于2型糖尿病的防治展示了較美好的前景。

表1 三組人群在800～900bp條帶檢出率

表2 三組人群在1200～1500bp條帶檢出率

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10.3969/j.issn.1001-8972.2010.11.098