曹傲能 汪蔚學(xué) 宇文泰然 鄧 巍 來魯華,*

(1上海大學(xué)納米化學(xué)與生物學(xué)研究所,上海 200444; 2北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,分子動態(tài)與穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)國家重點實驗室,北京分子科學(xué)國家實驗室,北京 100871)

小熱休克蛋白Mj HSP16.5對多肽纖維生長的抑制及對成熟纖維的解聚作用

曹傲能1,2,*汪蔚學(xué)2宇文泰然2鄧 巍2來魯華2,*

(1上海大學(xué)納米化學(xué)與生物學(xué)研究所,上海 200444;2北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,分子動態(tài)與穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)國家重點實驗室,北京分子科學(xué)國家實驗室,北京 100871)

包括老年癡呆癥在內(nèi)的許多疾病與蛋白質(zhì)或多肽的淀粉樣聚集(纖維化)有關(guān).由于這類疾病的機制尚不清楚,因此還沒有有效的預(yù)防和治療手段.研究各種因素如小熱休克蛋白對蛋白質(zhì)或多肽淀粉樣聚集的影響對開發(fā)防治相關(guān)疾病的藥物具有重要意義.甲狀腺素運載蛋白(TTR)及其突變體很容易形成淀粉樣纖維,并與多種疾病相關(guān).Mj HSP16.5是一種來源于嗜熱古細菌Methanococcus jannaschii的小熱休克蛋白,它在酸性條件下具有非常高的分子伴侶活性.本文研究了Mj HSP16.5對WTTR肽(在N端添加了色氨酸的TTR 105-115片段,序列為WYTIAALLSPYS)纖維化的影響,發(fā)現(xiàn)Mj HSP16.5能夠顯著地抑制WTTR肽纖維的生長,且在Mj HSP16.5存在下,WTTR肽形成的纖維比正常條件下形成的要顯著細小.尤其是Mj HSP16.5還可以使已經(jīng)成熟的WTTR肽纖維解離.結(jié)果表明,Mj HSP16.5抑制多肽纖維的機理可能在于其能夠與多肽纖維及纖維種子結(jié)合.

淀粉樣纖維; 抑制; 解聚; 小熱休克蛋白;Mj HSP16.5

許多疾病(包括老年癡呆癥、帕金森癥、二型糖尿病、家族性神經(jīng)系統(tǒng)綜合癥等)與蛋白質(zhì)或多肽的淀粉樣聚集(纖維化)有關(guān),這類疾病也稱為蛋白質(zhì)構(gòu)象病[1-7].現(xiàn)在一般認為所有蛋白質(zhì)在一定的條件下都可能形成纖維化聚集,甚至無規(guī)結(jié)構(gòu)的還原態(tài)溶菌酶都可以形成蛋白質(zhì)纖維[8].迄今為止,蛋白質(zhì)構(gòu)象病的很多機制尚不清楚,還沒有有效的預(yù)防和治療手段.影響蛋白質(zhì)或多肽的淀粉樣聚集的因素很多,如低于化學(xué)計量比的小熱休克蛋白就可以顯著抑制纖維的形成[9-14].研究這些因素對蛋白質(zhì)或多肽的淀粉樣聚集的影響對于闡明蛋白質(zhì)和多肽纖維的形成機制,開發(fā)防治蛋白質(zhì)構(gòu)象病的藥物和治療方法具有重要意義.

小熱休克蛋白是生物體對抗不利環(huán)境時大量表達的一類重要蛋白,常以寡聚體形式存在.小熱休克蛋白主要通過與變性蛋白或其折疊中間態(tài)結(jié)合形成復(fù)合物的方式來防止蛋白質(zhì)不可逆的變性聚集,從而發(fā)揮其分子伴侶活性.在外界應(yīng)急條件消失后,與小熱休克蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)可以在其他熱休克蛋白的幫助下重新折疊[15-16].Mj HSP16.5來源于嗜熱古細菌Methanococcus jannaschii(Mj),是最先得到晶體結(jié)構(gòu)的小熱休克蛋白[17].我們的前期研究工作表明Mj HSP16.5具有很高的抗變性劑穩(wěn)定性[18-20],而且Mj HSP16.5在酸性條件下具有非常高的分子伴侶活性[21].酸性環(huán)境是很多蛋白質(zhì)和多肽在體外實驗中形成纖維化聚集的條件之一,因此Mj HSP16.5非常適合來研究小熱休克蛋白對蛋白質(zhì)纖維形成機理的影響,但至今尚未見相關(guān)研究報道.

甲狀腺素運載蛋白質(zhì)(transtheritin,TTR)及其突變體很容易形成淀粉樣纖維,并與多種疾病相關(guān),包括家族性神經(jīng)系統(tǒng)綜合癥等.TTR的105-115片斷被認為是最易發(fā)生聚集的部位,在酸性條件下非常容易形成纖維化聚集.以這段多肽為模型,我們曾發(fā)展了一種研究多肽纖維拓撲結(jié)構(gòu)的FRET方法[22-23].本文選擇TTR的105-115片斷來研究Mj HSP16.5對纖維聚集的影響.為便于通過熒光來檢測多肽構(gòu)象的變化,我們在其N端增加了一個色氨酸殘基(序列為WYTIAALLSPYS,以下簡稱WTTR).

1 實 驗

1.1 材 料

Mj HSP16.5蛋白按照我們已報道的方法[19]進行表達提純.WTTR多肽通過固相合成方法合成,經(jīng)高效液相色譜(HPLC)提純,并以凍干粉末形式保存.為改善WTTR多肽粉末在水中的溶解情況,防止溶液渾濁,并且使WTTR在新配制的溶液中以單體存在,先用少量二甲基亞砜(DMSO)溶解WTTR(2 mg WTTR多肽溶解于10 μL DMSO),并超聲(CD-4800型,42 kHz,70 W)處理3 min,再用pH 2的鹽酸稀釋至所需的濃度,得到澄清的多肽溶液.除了特別說明,所有試劑均為分析純,水為超純水(Millipore).

1.2 纖維的培養(yǎng)

WTTR多肽(2 g·L-1)的pH 2水溶液在37℃恒溫培養(yǎng)3個月可以得到成熟纖維.成熟纖維通過超聲(CD-4800型,42 kHz,70 W)處理6-8 min制得纖維種子.

為檢測Mj HSP16.5對WTTR多肽形成纖維形態(tài)的影響,2 g·L-1多肽的pH 2水溶液在不同濃度Mj HSP16.5存在下在37℃恒溫培養(yǎng)45天.然后通過原子力顯微鏡(AFM,Shimadzu SPM-9600,日本)和透射電鏡(JEM-100CX,JOEL,日本)(樣品經(jīng)磷鎢酸負染)觀察纖維形貌,并統(tǒng)計纖維直徑.

為檢測Mj HSP16.5對WTTR多肽形成纖維的動力學(xué)的影響,用紫外酶標儀(SpectraMax190 Microplate Spectrophotometer,Molecular Devices,美國)測定溶液350 nm處的混濁度隨時間的變化,以表征存在/不存在Mj HSP16.5的條件下,種子引發(fā)的WTTR淀粉樣纖維化聚集速率變化.

為檢測Mj HSP16.5對WTTR多肽成熟纖維的影響,2 g·L-1成熟纖維(換算成WTTR單體濃度為1.4 mmol·L-1)與等體積0.39 mmol·L-1Mj HSP16.5混合,室溫放置5天.作為對照,1.4 mmol·L-1成熟纖維稀釋一倍,室溫放置5天.然后樣品經(jīng)磷鎢酸負染,電鏡觀察形貌,并統(tǒng)計纖維直徑.

1.3 Mj HSP16.5與WTTR多肽、纖維及種子的相互作用研究

通過測定Mj HSP16.5溶液,WTTR溶液,以及含有等摩爾Mj HSP16.5與WTTR混合溶液(平衡15 min)的色氨酸熒光光譜,比較Mj HSP16.5與WTTR混合前后的熒光光譜,以檢測兩者是否發(fā)生相互作用.

通過測定與淀粉樣纖維特異結(jié)合的熒光染料ThT(thioflavin T,Sigma,美國)的熒光變化來檢測Mj HSP16.5與WTTR纖維及種子的相互作用.

所有熒光實驗都在 Fluorolog-312熒光儀(HORIBA,Jobin Yvon,法國)上進行,并通過循環(huán)水浴控溫在25℃.

2 結(jié)果與討論

2.1 Mj HSP16.5抑制WTTR多肽自發(fā)纖維化

WTTR多肽可以自發(fā)纖維化,其溶液最終變成膠凍狀.圖1顯示的是典型的WTTR多肽纖維AFM和電鏡圖片,可以明顯看出WTTR多肽纖維是由多股細纖維纏繞而成的右旋結(jié)構(gòu).在Mj HSP16.5存在條件下,WTTR多肽溶液流動性較好,不會變成膠凍狀,說明Mj HSP16.5對多肽纖維形成起到了抑制作用.電鏡照片顯示在Mj HSP16.5存在下,WTTR多肽纖維明顯變細(圖1(c)).

從大量纖維直徑的統(tǒng)計結(jié)果(圖2A)可以看出,在Mj HSP16.5存在下,WTTR多肽聚集形成的淀粉樣纖維的直徑分布發(fā)生顯著變化,細纖維所占比例顯著增多.在沒有Mj HSP16.5存在時,沒有觀察到直徑在5 nm以下的細纖維,5-7 nm的纖維所占比例僅9.4%;最粗的纖維直徑可達26 nm.與此相比,在Mj HSP16.5存在下,直徑7 nm以下的細纖維占樣本總數(shù)的80%以上;而且沒有發(fā)現(xiàn)直徑大于15 nm的纖維.同時,在纖維形成的過程中,隨著小熱休克蛋白Mj HSP16.5濃度的增加,直徑在5 nm以下的纖維比例增加.在0.061 mmol·L-1Mj HSP16.5存在條件下,多肽纖維直徑在5 nm以下的占樣本總數(shù)的 24.7%;而當 Mj HSP16.5的濃度增加到 0.39 mmol·L-1,直徑在5 nm以下纖維的比例高達樣本總數(shù)的50%以上.可以看出,小熱休克蛋白Mj HSP16.5對淀粉樣纖維的直徑分布有顯著影響,使細纖維增加,粗纖維減少.

2.2 Mj HSP16.5使成熟WTTR多肽變細

不僅在多肽纖維形成過程中加入Mj HSP16.5可以顯著改變多肽纖維的形貌,在多肽自發(fā)形成成熟纖維后再加入Mj HSP16.5,也可以明顯使成熟纖維變細.從圖2B的統(tǒng)計結(jié)果可以看出,直接稀釋成熟纖維對纖維直徑基本沒有影響,而加入Mj HSP16.5后,多肽纖維直徑明顯向細小方向移動.證明Mj HSP16.5有使多肽纖維解離變小的作用.被打碎成為小片段的纖維,即纖維種子中加入Mj HSP 16.5后種子的形貌改變更加顯著.在Mj HSP16.5存在時,纖維種子中直徑小于7 nm的占70%以上,而且沒有直徑大于15 nm的纖維種子(圖2B).

2.3 Mj HSP16.5可以顯著降低種子誘導(dǎo)的WTTR多肽纖維化速率

在沒有纖維種子存在的條件下,蛋白質(zhì)和多肽形成纖維都需要經(jīng)過一個緩慢的形核過程;而在纖維種子存在的條件下,蛋白質(zhì)和多肽形成纖維是一個快速的生長過程.為了研究Mj HSP16.5對WTTR多肽纖維生長過程的動力學(xué)影響,在加入種子后,我們比較了纖維生長早期的生長速率.實驗結(jié)果表明,加入微量的Mj HSP16.5(Mj HSP16.5的濃度是9 μmol·L-1,而WTTR多肽的單體濃度是1.4 mmol· L-1,摩爾比1∶156)能夠顯著降低纖維聚集速率(吸光度變化速率從(1.32±0.09)×10-5s-1降低到(3.5±0.6)× 10-6s-1).如果用Mj HSP16.5預(yù)先和種子混合放置40 min,再加入WTTR多肽,則纖維聚集速率進一步減慢(吸光度變化速率降低到(2.4±0.2)×10-6s-1).

以上實驗中,Mj HSP16.5的單體濃度僅是WTTR單體濃度的0.6%,而WTTR聚集速率降低了70%以上,顯示Mj HSP16.5抑制纖維聚集的機理不可能是Mj HSP16.5與單體結(jié)合.比較合理的解釋是,小熱休克蛋白Mj HSP16.5與種子有相互作用.這也與上述Mj HSP16.5可以改變種子形貌相對應(yīng).多肽纖維被打碎成纖維種子后,在纖維斷面處暴露出疏水性斷面.而Mj HSP16.5能夠與蛋白質(zhì)/多肽疏水性強的部分結(jié)合,因而有可能結(jié)合到種子的斷面處,使種子不能引發(fā)多肽單體聚集形成纖維. Mj HSP16.5預(yù)先與種子混合后,有足夠的時間充分結(jié)合種子的生長斷面;而未經(jīng)此預(yù)處理的種子在誘導(dǎo)聚集時才加入Mj HSP16.5,Mj HSP16.5來不及與種子的斷面充分結(jié)合,聚集開始時種子暴露的斷面較多,因而其聚集速率比經(jīng)預(yù)處理的種子誘導(dǎo)的聚集速率要快.

2.4 Mj HSP16.5與WTTR多肽單體、纖維及其種子的相互作用

為了揭示Mj HSP16.5對WTTR多肽纖維生長的抑制機制,我們首先通過熒光光譜來探索Mj HSP16.5是否與WTTR多肽單體、纖維或纖維種子發(fā)生相互作用.

WTTR這段小肽的單體在水溶液中主要采取伸展構(gòu)象,位于其N端的色氨酸的側(cè)鏈可以在極性親水環(huán)境中自由轉(zhuǎn)動,因此其熒光信號非常小,如圖3A所示.而Mj HSP16.5具有較多的疏水結(jié)合界面,如果 Mj HSP16.5與 WTTR多肽單體結(jié)合,則WTTR多肽單體的疏水色氨酸將結(jié)合到Mj HSP16.5的疏水結(jié)合界面,從而改變WTTR多肽色氨酸的極性環(huán)境,并限制其側(cè)鏈的運動,結(jié)果會導(dǎo)致WTTR多肽色氨酸熒光的增強[24-25].然而,圖3A結(jié)果顯示,WTTR多肽單體和Mj HSP16.5混合后熒光并沒有增強,反而有微弱的降低,表明Mj HSP 16.5不與WTTR單體發(fā)生特異性相互作用,進一步證實Mj HSP16.5抑制多肽纖維的機制不是和多肽單體作用.

ThT是一種與淀粉樣纖維特異結(jié)合而熒光顯著增強的染料,因而常被用來定性和定量檢測蛋白質(zhì)和多肽纖維的生長[10].圖3B顯示了WTTR纖維及種子與Mj HSP16.5混合前后ThT熒光的變化.在加入少量Mj HSP16.5的WTTR纖維溶液中,ThT產(chǎn)生的熒光比未加入Mj HSP16.5的相同濃度的纖維樣品有明顯下降,比較合理的解釋是Mj HSP16.5結(jié)合到了纖維表面,占據(jù)了部分ThT可結(jié)合部位所導(dǎo)致的結(jié)果.另一個可能的原因是Mj HSP16.5使纖維變細甚至可能溶解部分纖維.在超聲處理后的纖維種子中加入Mj HSP16.5,也觀察到了熒光強度的下降.表明Mj HSP16.5與WTTR纖維及種子都有明顯的相互作用.而這種相互作用就是Mj HSP16.5抑制多肽纖維生長的根本原因.

電鏡實驗結(jié)果也證實Mj HSP16.5與WTTR纖維及種子都有明顯的相互作用.從Mj HSP16.5與WTTR多肽纖維及纖維種子結(jié)合的電鏡照片(圖4)中可以發(fā)現(xiàn)多處結(jié)合到纖維側(cè)面的球狀結(jié)構(gòu),即Mj HSP16.5(如圖4中箭頭所指).其中圖4(a)顯示了可能正在被Mj HSP16.5解離的WTTR纖維.在超聲處理后的纖維種子中加入Mj HSP16.5后,也可以觀測到Mj HSP16.5和種子結(jié)合的形態(tài)圖(圖4(b)).特別值得一提的是,作為對比,種子在放置一段時間后,細小的種子會逐漸恢復(fù)形成成熟的粗長纖維,而在Mj HSP16.5存在下,大量的纖維種子仍然保持為細小的纖維形態(tài),不僅沒有恢復(fù)形成成熟的粗長纖維(圖5),而且直徑進一步減小(見圖2B統(tǒng)計分布).這可能就是Mj HSP16.5抑制多肽纖維生長速率的機制,同時也很好地解釋了種子和Mj HSP16.5預(yù)先混合后纖維生長速率進一步下降的實驗結(jié)果.

3 結(jié) 論

我們研究了小熱休克蛋白Mj HSP16.5對來源于甲狀腺素運載蛋白質(zhì)的多肽WTTR的纖維化聚集的影響.結(jié)果表明,遠低于化學(xué)劑量比的Mj HSP16.5可以明顯抑制由種子引發(fā)的WTTR淀粉樣纖維化速率.在 Mj HSP16.5存在的條件下, WTTR多肽形成的纖維明顯比正常纖維細小.Mj HSP16.5還能夠使成熟纖維和纖維種子解離變細. Mj HSP16.5抑制多肽纖維生長并解離成熟纖維的主要原因可能在于Mj HSP16.5可以結(jié)合到纖維和纖維種子上.研究結(jié)果對如何清除蛋白質(zhì)和多肽纖維以及開發(fā)治療蛋白質(zhì)構(gòu)象病的藥物具有啟示作用.

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Inhibition of Amyloid Fibrillization and Dissociation of Matured Amyloid Fibrils by Mj HSP16.5

CAO Ao-Neng1,2,*WANG Wei-Xue2YUWEN Tai-Ran2DENG Wei2LAI Lu-Hua2,*
(1Institute of Nanochemistry and Nanobiology,Shanghai University,Shanghai 200444,P.R.China;2Beijing National Laboratory of Molecular Sciences,State Key Laboratory for Structural Chemistry of Unstable and Stable Species,College of Chemistry and Molecular Engineering,Peking University,Beijing 100871,P.R.China)

The amyloid fibrillization of proteins and peptides is related to many human diseases including Alzheimer′s disease.Currently there is no effective therapy for these diseases,because the mechanism of the amyloid fibrillization is still not clear.Understanding how to effectively inhibit amyloid formation will shed light on the prevention and treatment of these diseases.Transtheritin(TTR)and its mutants easily form amyloid fibrils and are related tomanydiseases.MjHSP16.5,asmallheatshockprotein(SHSP)from Methanococcusjannaschii showshighchaperonelike activity under acidic conditions,and these conditions promote the fibrillization of many peptides.We studied the influence of Mj HSP16.5 on the fibrillization of the peptide WTTR(sequence:WYTIAALLSPYS,i.e.,the 105-115 fragment of TTR with a tryptophan added to its N-terminal).Mj HSP16.5 was found to significantly inhibit the growth and maturation of the WTTR fibrils resulting in much thinner fibrils compared to those under normal conditions.More interestingly,Mj SHSP16.5 can dissociate the matured WTTR fibrils.Based on our experimental results,a possible inhibition mechanism was proposed in which Mj SHP16.5 interacted with WTTR fibrils and/or seeds.

Amyloid fibril;Inhibition;Dissociation; Small heat shock protein;Mj HSP16.5

O641

Received:February 1,2010;Revised:May 10,2010;Published on Web:May 18,2010.

*Corresponding author.Email:ancao@shu.edu.cn,lhlai@pku.edu.cn;Tel:+86-21-66135277,+86-10-62757486.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20673003),National Key Basic Research Program of China(973) (2009CB930200),Shanghai Municipal Education Committee,China(09YZ16),and Shanghai Leading Academic Disciplines,China(S30109).

國家自然科學(xué)基金(20673003),國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項目(973)(2009CB930200),上海市教委(09YZ16)和上海市重點學(xué)科(S30109)資助

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