曾 涵 廖鈴文 李明芳 陶 騫 康 婧 陳艷霞

(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)物理系,合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室(籌),合肥 230026)

聚芳酰胺-多壁碳納米管混合物固定漆酶電極的電化學(xué)行為

曾 涵 廖鈴文 李明芳 陶 騫 康 婧 陳艷霞*

(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)物理系,合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室(籌),合肥 230026)

以聚芳酰胺-多壁碳納米管混合物為載體,利用漆酶表面氨基與聚芳酰胺主鏈端羧基的共價(jià)偶聯(lián)以及碳納米管與漆酶間的疏水作用,構(gòu)筑了具有較高穩(wěn)定性和電催化活性的漆酶修飾電極.并對(duì)該固酶修飾電極的固酶量、酶活力、電化學(xué)行為及其電催化氧還原的性能進(jìn)行了表征.對(duì)漆酶分子具有親和力的聚芳酰胺芳環(huán)結(jié)構(gòu)及聚芳酰胺端羧基與漆酶表面氨基的共價(jià)偶聯(lián)避免了漆酶的脫落和變性.而碳納米管與聚芳酰胺的混合使得該三維修飾電極具有良好的電子導(dǎo)電性,并成功地實(shí)現(xiàn)了漆酶的氧化還原活性位與電極之間的直接電荷轉(zhuǎn)移,這一點(diǎn)可由在0.73和0.38 V附近觀察到漆酶的T1和T2(漆酶的T1,T2銅活性位的形式電位分別為0.78和0.39 V(vs NHE))銅活性位的兩對(duì)氧化還原峰確認(rèn).漆酶的擔(dān)載量為56.0 mg·g-1,具有電化學(xué)活性的漆酶占總擔(dān)載漆酶量的68%.在pH=4.4磷酸鹽緩沖溶液中,該修飾電極上氧氣還原的起始電位為0.55 V,其對(duì)氧氣的米氏常數(shù)KM為55.8 μmol·L-1,對(duì)氧氣的檢測(cè)限為0.57 μmol·L-1.在4℃下保存兩個(gè)月后能實(shí)現(xiàn)直接電荷轉(zhuǎn)移的漆酶量?jī)H下降了14%左右而氧還原超電勢(shì)提高了約50 mV.結(jié)果表明該修飾電極有望用作酶基生物燃料電池的陰極和電流型氧氣傳感器.

漆酶;直接電子遷移;氧還原;生物電催化;生物傳感器

漆酶(Lac)是一類含銅的多酚氧化酶,能催化氧化許多芳香化合物,同時(shí)使氧氣還原成水[1].漆酶的活性中心由四個(gè)銅離子組成,按照譜學(xué)特征分為三組[2]:T1(含有一個(gè)接近酶分子疏水表面的銅離子,一般認(rèn)為這個(gè)活性位點(diǎn)是主要的電子受體),T2(含有一個(gè)銅離子)和T3位(包含兩個(gè)銅離子,一般認(rèn)為氧分子在T2和T3形成的三核銅簇上結(jié)合時(shí),通過接受來自T1位的電子并形成水分子).由于漆酶能在較高電位(接近其T1位的形式電位0.78 V vs RHE)下催化氧還原反應(yīng),而且氧還原反應(yīng)速率快,選擇性好,因此漆酶被認(rèn)為是微型生物燃料電池較有潛力的陰極氧還原反應(yīng)的催化劑[3-6].但是與其它酶催化劑類似,漆酶的活性中心被酶蛋白質(zhì)骨架包裹,使該活性中心與導(dǎo)電基底間的直接電子遷移不易實(shí)現(xiàn),而且酶修飾電極易受環(huán)境因素影響而失去活性,因此構(gòu)筑能進(jìn)行電極-酶活性中心間直接電荷遷移,并具有高穩(wěn)定性以及高漆酶擔(dān)載量和利用率的漆酶修飾電極是成功實(shí)現(xiàn)上述應(yīng)用的關(guān)鍵,也是近期研究的熱點(diǎn)之一[79].

文獻(xiàn)報(bào)道構(gòu)筑漆酶修飾電極所采用的方法可大致分為以下幾類:i)利用分子導(dǎo)線直接連接電極與漆酶的活性中心[10-11];ii)向電極體系中引入可自由擴(kuò)散的電荷轉(zhuǎn)移媒介體或?qū)㈦姾赊D(zhuǎn)移媒介以物理吸附或化學(xué)偶聯(lián)作用固定在固酶載體的三維結(jié)構(gòu)中[12-17];iii)以由兼具親漆酶結(jié)構(gòu)的聚合物以及導(dǎo)電性物質(zhì)組成的混合物為載體擔(dān)載漆酶,如將漆酶固定在熱敏性水凝膠[18],納米多孔導(dǎo)電材料中[19]或是將漆酶固定在具有生物親和力的親水/親油分子修飾的導(dǎo)電載體(如碳納米管或碳微晶體)的三維體相結(jié)構(gòu)中[2021].

其中第一種方法利用分子導(dǎo)線直接將漆酶的活性中心與電極表面導(dǎo)通,其效率在理論上應(yīng)該最高,但目前對(duì)漆酶活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)及活性位點(diǎn)周圍的化學(xué)環(huán)境的認(rèn)識(shí)并不充分,也很難將漆酶的活性中心如同文獻(xiàn)報(bào)道[22]的葡萄糖氧化酶那樣進(jìn)行去輔基處理,以達(dá)到在電極上進(jìn)行重構(gòu)以實(shí)現(xiàn)電極與活性中心的直接導(dǎo)通的目的.最近,Armstrong研究小組[10-11]發(fā)現(xiàn)以具有強(qiáng)疏水多芳環(huán)的稠環(huán)芳烴重氮鹽修飾的電極可以較穩(wěn)定地吸附漆酶并促進(jìn)電子在電極基底和漆酶T1位的氧化還原中心間的遷移,并能在0.9 V(vs RHE)左右實(shí)現(xiàn)氧氣的電催化還原.但使用的蒽和其它稠環(huán)芳烴對(duì)環(huán)境有較強(qiáng)的污染,其作為電極修飾劑進(jìn)行推廣應(yīng)用存在一定限制,而且利用該方法只能實(shí)現(xiàn)擔(dān)載在電極表面第一單層的漆酶分子與電極基底之間的有效導(dǎo)通,因此要提高單位面積的電流密度還有待于發(fā)展三維的固酶電極.

第二種方法所采用的擴(kuò)散型媒介體:一方面反應(yīng)的輸出電壓受電子媒介體的氧化還原電位所制約,因此選擇合適的媒介體非常關(guān)鍵;另一方面,即使在其它條件完全優(yōu)化后,媒介體的傳質(zhì)步驟很可能成為整個(gè)反應(yīng)的決速步驟,從而限制電極性能的進(jìn)一步提升.最近報(bào)道的采用與高分子骨架以配位鍵相聯(lián)的具有可逆氧化還原行為的金屬離子絡(luò)合物作為電子媒介體的漆酶修飾電極其氧還原的起始電位可高達(dá)0.78 V,在氧氣飽和的溶液中其極限擴(kuò)散電流密度達(dá)到325 mA·cm-2[17].但是該方法存在成本高、使用了有毒的貴金屬,制備純化工藝復(fù)雜等缺陷.

第三種方法通過采用多孔導(dǎo)電載體制備三維電極從而大大提高單位面積的固酶量,如果能有效控制漆酶在此三維結(jié)構(gòu)中取向和構(gòu)型,使之利于漆酶活性中心和導(dǎo)電載體之間的電子遷移,并維持其活性位構(gòu)象及其疏松多孔性,從而利于反應(yīng)物如氧氣的傳輸與在活性位的轉(zhuǎn)化,那將最有可能開發(fā)出具有高反應(yīng)活性和穩(wěn)定性的可實(shí)用酶修飾電極.但目前文獻(xiàn)報(bào)道采用該策略制備的漆酶修飾電極普遍存在不能可控地調(diào)控三維多孔載體結(jié)構(gòu)中漆酶的取向以保持其利于電子隧穿以及反應(yīng)物、產(chǎn)物傳質(zhì)的構(gòu)型,因此所制備的酶修飾電極還存在氧還原的超電勢(shì)高,酶電極的長(zhǎng)期穩(wěn)定性不太好等缺點(diǎn)[3,9,20].

多壁碳納米管(MWCNTs)具有高比表面,較好的導(dǎo)電能力且表面有一定疏水性和生物兼容性,被認(rèn)為可能是實(shí)現(xiàn)酶活性中心和電極之間的直接電子傳遞的理想導(dǎo)線.但是,對(duì)碳納米管固酶修飾電極的研究表明多壁碳納米管易于在水溶液中團(tuán)聚,不但降低載體與漆酶的有效接觸表面積,而且增加底物向漆酶活性位傳輸?shù)奈蛔?使固定漆酶與底物親和力下降從而大大降低了其對(duì)氧氣和其它有機(jī)物的催化能力[3,2324],此外,研究表明漆酶與納米管直接作用時(shí)可能導(dǎo)致漆酶的構(gòu)象變化,使其不利于酶活性中心與電極間的直接電子遷移[3].

本文試圖結(jié)合第一類和第三類方法的特點(diǎn),使用具有良好導(dǎo)電性的碳納米管和對(duì)漆酶分子有較好親和力的聚芳酰胺(PAA)的混合物作為固酶載體(PAA經(jīng)過脯氨酸處理后在端基接枝了羧基),利用共價(jià)偶聯(lián)、疏水作用來固定云芝漆酶,并將固酶混合物修飾到玻碳電極(GCE)上制成漆酶修飾電極(用Lac/PAA-MWCNTs/GC表示).PAA以對(duì)苯二甲酰氯和己二胺為原料縮聚得到,PAA與MWCNTs共混得到PAA-MWCNTs混合物再經(jīng)脯氨酸處理后,就能得到主鏈兩端都含有羧基的嵌段聚合物.一方面,該混合物中含對(duì)漆酶具有親和力的芳環(huán)結(jié)構(gòu),有助于維持漆酶在電極上利于電子隧穿的構(gòu)象;另一方面經(jīng)脯氨酸處理的PAA的兩個(gè)端基也可與漆酶外表面賴氨酸殘基[25]中氨基(至少有四個(gè))形成酰胺鍵,從而可牢固地固定漆酶;碳納米管的疏水側(cè)壁和中空管也可物理吸附漆酶分子,因此混合物不但具有更高的固酶載量,而且通過納米管的中空結(jié)構(gòu)擴(kuò)大了固定漆酶與底物接觸面積,因此固定漆酶與底物的親和力也會(huì)得到相應(yīng)的改善.多壁碳納米管的引入,又克服了該嵌段共聚物的電子導(dǎo)電性差的缺點(diǎn),有可能在不加任何電子媒介體的情況下實(shí)現(xiàn)酶活性中心和電極之間的直接電子遷移.以循環(huán)伏安法研究了該修飾電極在除氧的磷酸鹽緩沖液中的直接電化學(xué)特征,考察了此固酶修飾電極氧還原催化能力及其長(zhǎng)期穩(wěn)定性,同時(shí)還測(cè)定了固定漆酶對(duì)底物氧氣的親和力及氧氣檢測(cè)限.研究表明, Lac/PAA-MWCNTs/GC具有良好的穩(wěn)定性和氧還原催化性能,有望用作酶基生物燃料電池陰極和電流型氧氣傳感器.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 化學(xué)試劑

對(duì)苯二甲酰氯、己二胺、CCl4、NaOH、HCl、脯氨酸、甲醇等試劑均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;N-乙基-N'-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC),N-羥基丁二酰亞胺(NHS)均為分析純,購(gòu)自阿拉丁試劑公司(中國(guó));純化的云芝漆酶(相對(duì)分子質(zhì)量為68000)及相應(yīng)底物2,6-二甲氧基苯酚(DMP) (分析純)購(gòu)自美國(guó)Sigma化學(xué)試劑有限公司.實(shí)驗(yàn)過程中使用的緩沖溶液為0.2 mol·L-1的磷酸二氫鉀緩沖液(PBS,pH=4.4),所有溶液均用Milli-Q超純水配制.多壁碳納米管(MWCNTs)(直徑20-40 nm,長(zhǎng)度5-15 μm)購(gòu)自深圳納米港有限公司.其他試劑未加說明均為分析純.

1.2 聚芳酰胺(PAA)的制備

稱取1.35 g對(duì)苯二甲酰氯,振搖以盡量使對(duì)苯二甲酰氯溶解于CCl4中;另稱取己二胺0.77 g和NaOH 0.53 g,共用100 mL水將其分別溶解后混合均勻,配成水相,將有機(jī)相與水相混合,將反應(yīng)混合物于磁力攪拌下室溫反應(yīng)4 h,再將生成的聚芳酰胺放入盛有200 mL 1%的HCl水溶液中浸泡后,用水充分洗滌至中性,再用蒸餾水洗后壓干,粉碎,80℃真空干燥24 h.

1.3 Lac/PAA-MWCNTs/GC的制備

芳酰胺-多壁碳納米管固定漆酶復(fù)合物的制備過程參見Scheme 1.首先,MWCNTs按文獻(xiàn)方法[26]以濃硝酸處理后使用,然后將5 mg經(jīng)純化處理過的MWCNTs與5 mg PAA縮聚物,1.5 mL無水甲醇的水溶液(甲醇和水的體積比為1:3),75 mmol·L-1EDC-15 mmol·L-1NHS混合液400 μL在磁力攪拌下共混6 h,得到一黑色粘稠懸濁液.在20℃,7000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心分離(德國(guó)Sigma 2K15型高速離心機(jī))將上層清液倒去,以磷酸鹽緩沖液沖洗黑色粘稠物以除去表面上吸附的EDC-NHS分子,重復(fù)前述步驟3次,最后得到為PAA與MWCNTs的混合物PAA-MWCNTs.接著向體系中加入1.5 g·L-1脯氨酸溶液,并對(duì)該混合物溶液磁力攪拌20 min后于室溫靜置6 h,將上清液除去并再次向體系中加入75 mmol·L-1EDC-15 mmol·L-1NHS混合液400 μL以活化PAA上主鏈兩端接枝的脯氨酸殘基上的羧基,室溫下靜置6 h后倒去上清液,用PBS清洗黑色粘稠的復(fù)合物3次,以除去體系中剩余的EDC和NHS,得到端羧基活化的PAA主鏈兩端接枝脯氨酸(proline)的修飾PAA,用pro-g-PAA-MWCNTs表示.抽取400 μL 1.1 g·L-1漆酶(溶解于PBS)與400 μL上述pro-g-PAA-MWCNTs共混,磁力攪拌30 min后放在4℃冰箱中過夜保存.將混合液中上層清液傾去,以PBS清洗懸濁液3次以除去在固酶基元上吸附不牢的漆酶分子.所制備的黑色粘稠液平時(shí)儲(chǔ)存于4℃冰箱中.吸取15 μL上述黑色粘稠液體滴涂在玻碳電極表面,4℃下干燥后得到固定漆酶修飾電極,即Lac/PAA-MWCNTs/GC.

1.4 漆酶復(fù)合物中漆酶擔(dān)載量以及固酶比活力的測(cè)定

聚芳酰胺-多壁碳納米管復(fù)合物固定漆酶量按照文獻(xiàn)方法[27]測(cè)定,以石墨爐原子吸收法(Analyst 800型原子吸收光譜儀,美國(guó)Perkin-Elmer公司,主機(jī):雙光束火焰/石墨爐原子吸收分光光度計(jì),光譜范圍:190-870 nm)測(cè)定復(fù)合物固定漆酶載量,由于每個(gè)漆酶分子含有四個(gè)銅離子,故可以通過下述公式計(jì)算漆酶固定百分率:

漆酶固定百分率=[(加入漆酶的含銅量-未固定漆酶的含銅量)/加入漆酶的含銅量]×100%

固定漆酶擔(dān)載量=[(漆酶母液濃度×母液體積×漆酶固定百分率)/固酶復(fù)合物載體質(zhì)量]×100%

復(fù)合物固定漆酶的比活力測(cè)定參照文獻(xiàn)方法[19,25]進(jìn)行,將制備的固酶復(fù)合物與3 mL pH為4.4的PBS緩沖液和100 μL的10 mmol·L-1DMP混合液共混1 min后,迅速移取上清液到比色皿中并測(cè)定溶液中DMP氧化產(chǎn)物2,6-二甲氧基苯醌在470 nm處的吸光度(U-2810型紫外可見分光光度計(jì),日本島津公司,比色皿厚度1 cm),記錄吸光度對(duì)時(shí)間的關(guān)系曲線.2,6-二甲氧基苯醌的摩爾吸光系數(shù)為49600 L·mol-1·cm-1[19],定義酶活力單位為1 min內(nèi)氧化1 μmol DMP所需要漆酶的量.

1.5 Lac/PAA-MWCNTs/GC修飾電極的電化學(xué)行為表征及氧還原能力測(cè)試

采用常規(guī)三電極電解池進(jìn)行電化學(xué)實(shí)驗(yàn).Lac/ PAA-MWCNTs/GC(GC,直徑6 mm,購(gòu)自天津艾達(dá)恒晟工貿(mào)有限公司)作為工作電極.玻碳電極使用前先用3500#砂紙打磨,然后依次用1.0、0.5 mm粒徑的氧化鋁粉漿拋光,然后再用丙酮和超純水超聲清洗各兩次,每次2-3 min.對(duì)電極為鉑片電極,參比電極為Ag/AgCl電極,電化學(xué)測(cè)量在CHI-1140A型電化學(xué)分析儀(CHI Inc,上海辰華)上進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)中磷酸鹽緩沖液不斷通入超純N2(南京特氣)除氧.本文中的所有電勢(shì)都是相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)氫參比電極,所有的循環(huán)伏安曲線(CV)均經(jīng)過 IR補(bǔ)償.在 Lac/ PAA-MWCNTs/GC的氧還原催化實(shí)驗(yàn)中,不斷向PBS溶液中通O2(南京特氣)15 min以使PBS為氧氣飽和.測(cè)試溫度:(25.0±0.4)℃,在此溫度下PBS中氧氣的飽和濃度為1.1 mmol·L-1[6],而空氣飽和的PBS中氧氣濃度為260 μmol·L-1[17].計(jì)時(shí)電流法測(cè)定氧氣濃度的實(shí)驗(yàn)在含有不同濃度氧氣的PBS溶液中進(jìn)行,這一系列不同氧氣濃度的PBS緩沖液由通氮除氧的PBS緩沖液中加入不同體積的空氣飽和的PBS緩沖液制得.氧還原反應(yīng)的電壓恒定在0.35 V.

2 結(jié)果與討論

2.1 漆酶在PAA-MWCNTs上的擔(dān)載量和固定漆酶的比活力

實(shí)驗(yàn)測(cè)得聚芳酰胺-多壁碳納米管復(fù)合物固定漆酶的百分率為63.6%,漆酶擔(dān)載量為56.0 mg·g-1,固定漆酶的比活力為1.18 U·mg-1.較文獻(xiàn)報(bào)道[25]的(共價(jià)偶聯(lián)法固定漆酶)納米多孔金的固酶量(16.0 mg· g-1)和漆酶比活力(0.83 U·mg-1)高很多.除了前述的聚芳酰胺基元主鏈兩側(cè)的羧基可以與漆酶分子表面賴氨酸基團(tuán)中的氨基發(fā)生化學(xué)偶聯(lián)[25]之外,聚芳酰胺主鏈的疏水芳環(huán)[10-11],碳納米管的疏水側(cè)壁與漆酶分子間的良好相容性[3,10]也可能是復(fù)合物基元具有高固定漆酶量和高固酶比活力的原因之一.

2.2 Lac/PAA-MWCNTs/GC修飾電極的直接電化學(xué)行為

圖1中的實(shí)線為L(zhǎng)ac/PAA-MWCNTs/GC修飾電極在無氧PBS中的循環(huán)伏安曲線.從圖1中可以看出:在正向掃描過程中分別在0.78和0.43 V出現(xiàn)兩個(gè)氧化峰;而在逆向掃描過程中所對(duì)應(yīng)的還原峰分別在0.68和0.33 V出現(xiàn).對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明,在除氧PBS緩沖液中,純聚芳酰胺修飾的GCE電極(PAA/GC)在給定的掃描電位區(qū)間內(nèi)沒有出現(xiàn)任何氧化還原峰(圖1點(diǎn)線);在以聚芳酰胺與碳納米管混合物修飾的GC電極(PAA-MWCNTs/GC)上也未觀察到任何氧化還原峰(圖1虛線),而偶聯(lián)漆酶的聚芳酰胺修飾玻碳電極由于缺乏導(dǎo)電粒子以致于幾乎觀察不到任何氧化還原峰(圖不再給出).另外,文獻(xiàn)報(bào)道[3]碳納米管直接吸附漆酶后修飾GC電極也沒有觀察到任何氧化還原信號(hào).這兩對(duì)氧化還原峰的平均值分別為0.73和0.38 V,與文獻(xiàn)[5]報(bào)道的漆酶T1和T2活性中心的形式電位(分別是0.78和0.39 VvsNHE)接近,根據(jù)上述事實(shí)我們推斷這兩對(duì)氧化還原峰可能分別來自漆酶活性中心T1和T2位銅離子的氧化還原.說明在固定漆酶的PAA與多壁碳納米管混合物修飾的玻碳電極上實(shí)現(xiàn)了云芝漆酶與電極表面之間的直接電子轉(zhuǎn)移,無需加入任何電子中介體.

從圖1中Lac/PAA-MWCNTs/GC電極在PBS緩沖液中CV曲線,依據(jù)其氧化還原峰的積分面積以及下述公式可以求算出該修飾電極上具有電化學(xué)活性的漆酶的擔(dān)載量Γ*(mol·cm-2):

其中Q為位于0.73 V的氧化還原峰的電量(扣除雙層充電電量),z按文獻(xiàn)報(bào)道[5,19]的漆酶活性結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制可設(shè)定傳遞電子數(shù)為1,F為法拉弟常數(shù),A為電極的幾何表面積,為0.283 cm2.由此計(jì)算得出的Lac/PAA-MWCNTs/GC上漆酶的平均覆蓋度為6.3×10-9mol·cm-2.這個(gè)數(shù)值比理論上漆酶在電極表面單分子層吸附的量(約4.64×10-12mol·cm-2,以漆酶的最大橫截面積為35.8 nm2估算)[25]要高得多,大約相當(dāng)于1350單層漆酶緊密堆積在電極表面,較文獻(xiàn)報(bào)道[19]的納米多孔金固定漆酶的覆蓋率(2.1× 10-11mol·cm-2)高了兩個(gè)數(shù)量級(jí).這也與前述以石墨爐原子吸收法測(cè)定復(fù)合物固定漆酶載量較高的結(jié)論相一致.此外根據(jù)漆酶在載體上的擔(dān)載量,固酶載體質(zhì)量(3.2 mg)及Lac/PAA-MWCNTs/GC上漆酶的平均覆蓋度,電極的幾何面積(0.283 cm2)和漆酶的相對(duì)分子質(zhì)量為68000[25,28],可以計(jì)算出具有電活性的漆酶分子占固定漆酶分子總數(shù)的百分?jǐn)?shù)為67.6%.圖2為L(zhǎng)ac/PAA-MWCNTs/GC組裝后和于4℃下存放兩個(gè)月后于無氧磷酸鹽緩沖液中測(cè)試得到的循環(huán)伏安曲線.從圖2中可以看出Lac/PAAMWCNTs/GC在組裝后立即在無氧磷酸鹽緩沖液測(cè)得的CV(圖2實(shí)線)和4℃下存放兩個(gè)月后再于無氧磷酸鹽緩沖液中測(cè)得的CV(圖2虛線)形狀相似,峰電流大體不變,只是峰電位負(fù)向移動(dòng)了大約50 mV.這表明:Lac/PAA-MWCNTs/GC修飾電極的低溫下長(zhǎng)期保存仍然具有相當(dāng)程度的穩(wěn)定性(由峰面積求算得到的具有電活性的漆酶分子是電極新制備時(shí)的86%).

2.3 Lac/PAA-MWCNTs/GC修飾電極的氧還原催化性能及催化穩(wěn)定性表征

在Lac/PAA-MWCNTs/GC上有效地實(shí)現(xiàn)電子在電極與復(fù)合物固定漆酶的活性中心間直接遷移的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步研究了該固酶修飾電極對(duì)氧氣的電催化還原的性能.圖3是Lac/PAA-MWCNTs/ GC在除氧(點(diǎn)線),空氣飽和(虛線)和氧氣飽和(實(shí)線)的磷酸鹽緩沖液中的循環(huán)伏安曲線.從圖3中可以看出在磷酸鹽緩沖液中,無論溶液為空氣飽和還是被氧氣飽和,Lac/PAA-MWCNTs/GC的氧還原都始于0.55 V,氧還原電流密度都隨著電極電勢(shì)的負(fù)移和氧濃度的增加而增加,并在0.35 V附近達(dá)到極限擴(kuò)散電流.比文獻(xiàn)報(bào)道的納米多孔金固定漆酶電極的氧還原起始電位正移了約0.1 V[19].與文獻(xiàn)報(bào)道[18]的聚異丙基丙烯酰胺水凝膠固定漆酶修飾ITO電極相比(在峰出現(xiàn)位置相近的情況下),氧化還原峰更明顯,峰形更好.但與近來Armstrong等[10-11]利用稠環(huán)芳烴重氮鹽固定漆酶修飾熱解石墨電極的氧還原起始電位0.9 V相比低了約0.35 V,與最近文獻(xiàn)報(bào)道的含鋨基配體的氧化還原聚合物固定漆酶的氧還原起始電位[17]相比低了約0.3 V.

圖4是Lac/PAA-MWCNTs/GC電極催化氧氣還原的穩(wěn)定性測(cè)試,從圖中可以看出該電極的氧還原催化的穩(wěn)定性較好,在4℃下保存2個(gè)月后催化氧還原的超電勢(shì)僅負(fù)移了大約50 mV.

從氧還原的起始電位和不同氧濃度下催化還原電流的響應(yīng)來看,盡管制備Lac/PAA-MWCNTs/ GC修飾電極中酶的擔(dān)載量高,而且所擔(dān)載的酶中其活性中心能與電極間直接發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移的酶的比例高達(dá)70%,但是該電極還存在著氧還原電流隨O2的濃度增加不太明顯的缺陷.從空氣飽和的溶液到氧氣飽和的溶液,氧氣的濃度提高了約5倍,氧還原的極限電流卻僅提高了1.5倍.這可能是由于覆蓋在電極上的固酶復(fù)合物基元過厚,對(duì)氧氣傳質(zhì)形成一定的障礙.本文還對(duì)Lac/PAA-MWCNTs/GC的重復(fù)使用性進(jìn)行了研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:此固酶修飾電極在氧氣飽和的0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH=4.4)中重復(fù)使用8次后氧還原的峰電位沒有發(fā)生變化,氧還原極限電流仍然可以達(dá)到初次使用時(shí)的85%左右(圖不再給出),優(yōu)于文獻(xiàn)[25]報(bào)道的納米多孔金固定漆酶在類似體系中的重復(fù)使用性(固定漆酶的活力在重復(fù)使用8次后僅為初始活力的大約65%).

盡管本文制備的此種固酶修飾電極的氧還原的超電勢(shì)較高,氧氣的傳質(zhì)阻力大,但利用本方法制備酶修飾電極不需使用復(fù)雜的制備和純化工序、對(duì)環(huán)境有害的稠環(huán)芳烴或重金屬絡(luò)合物以及昂貴的電子中介體,因此該修飾電極與前述性能較高的酶修飾電極而言仍然具有一定的優(yōu)勢(shì).因此,下一步我們將嘗試通過采用改善聚合物結(jié)構(gòu)(例如改變聚合物形貌,增大比表面積以及進(jìn)一步對(duì)聚合物結(jié)構(gòu)改性增加側(cè)鏈上可鍵合漆酶分子的官能團(tuán)數(shù)目),減小氧氣和其它底物在固酶基元修飾層中傳質(zhì)阻力,改善固酶基元與底物親和力的方法來提高其電催化性能.

2.4 Lac/PAA-MWCNTs/GC修飾電極作為氧傳感器測(cè)定氧氣的濃度

圖5是Lac/PAA-MWCNTs/GC電極在無氧溶液中連續(xù)注入不同體積空氣飽和溶液時(shí)產(chǎn)生響應(yīng)電流的計(jì)時(shí)電流曲線.從圖5中可以看出(從文獻(xiàn)[7]可知:實(shí)驗(yàn)溫度下空氣飽和水溶液中氧氣濃度可以設(shè)定為260 μmol·L-1):在氧氣濃度從1.7-13.2 μmol·L-1的范圍內(nèi),催化電流與氧氣濃度成線性關(guān)系.氧氣濃度檢測(cè)限為0.57 μmol·L-1(S/N=3),其檢測(cè)下限不到文獻(xiàn)報(bào)道[6]的納米管-殼聚糖固定漆酶氧傳感器的氧氣濃度檢測(cè)限7.8 μmol·L-1的十分之一,而且無需加入中介體;由Lineweaver-Burk曲線(濃度倒數(shù)-催化電流倒數(shù))可以推算KM=55.8 μmol· L-1,較文獻(xiàn)報(bào)道[6]的納米管-殼聚糖固定漆酶氧傳感器的KM=3.22 mmol·L-1低得多.

3 結(jié)論

利用共價(jià)偶聯(lián)成功制備了Lac/PAA-MWCNTs/ GC電極,通過石墨爐原子吸收法和分光光度法表征了酶在PAA-MWCNTs復(fù)合物上的擔(dān)載量以及固定漆酶的比活力.并以電化學(xué)方法(循環(huán)伏安,計(jì)時(shí)電流法)表征了此電極的電化學(xué)行為和氧還原催化性能.研究表明:PAA-MWCNTs復(fù)合物固定漆酶的量較高且固定漆酶具有較高的比活力;Lac/ PAA-MWCNTs/GC電極在不含任何電子中介體的無氧磷酸鹽緩沖液中能夠?qū)崿F(xiàn)酶活性中心與導(dǎo)電基體間的直接電子遷移,而且相當(dāng)部分的固定漆酶具有電活性,此種固酶修飾電極具有較好的重復(fù)使用性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性;在含氧溶液中,酶修飾電極生物電催化氧還原始于0.55 V,在大約0.35 V達(dá)到極限擴(kuò)散電流.該電極對(duì)氧的檢測(cè)限低至不足1 μmol·L-1,同時(shí)具有較高的氧親和力,說明同時(shí)采用含有大比表面納米結(jié)構(gòu)的導(dǎo)電基體和對(duì)漆酶有兼容性的材料(與漆酶活性中心性質(zhì)匹配或是具有能與漆酶活性中心鄰近部位的基團(tuán)發(fā)生化學(xué)鍵合的官能團(tuán))為載體固定漆酶,有望開發(fā)出高效的酶催化生物燃料電池的陰極以及電流型氧傳感器,這方面的工作還在進(jìn)行之中.

致謝： 本文特在此向中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)物理系張廣照教授及其研究小組給予的技術(shù)幫助和資金支持表示衷心的感謝.

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Poly Aryl Amide and Multiwalled Carbon Nanotube Composite Supported Laccase Electrode and Its Electrochemical Behavior

ZENG Han LIAO Ling-Wen LI Ming-Fang TAO Qian KANG Jing CHEN Yan-Xia*
(Hefei National Laboratory for Physical Sciences at Microscale,Department of Chemical Physics, University of Science and Technology of China,Hefei 230026,P.R.China)

A novel strategy for the immobilization of laccase onto a glassy carbon electrode with high stability and electrocatalytic performance is presented.Laccase is attached to a matrix of mixed poly aryl amide(PAA)and multiwalled carbon nanotubes(MWCNTs)(denoted Lac/PAA-MWCNTs/GCE)by covalently bonding the surface amine group of laccase to the terminal carboxyl group of PAA and hydrophobic-hydrophobic interaction between MWCNTs and the laccase.The PAA backbone avoids the detachment and denaturing of the laccase,and the intermixed MWCNTs provide high electronic conductivity. The loading of laccase is 56.0 mg·g-1and more than 68%shows electrochemical activity.The electrode delivers direct electron transfer between the redox center of the laccase and the electrode with two pairs of redox peaks at 0.73 and 0.38 V,which is close to the formal potential of the T1and T2Cu-sites(0.78 and 0.39 V(vs NHE)),respectively.The onset potential for O2reduction reaction(ORR)is ca 0.55 V in a phosphate buffer solution(pH=4.4).The Michaelis constant(KM)of the Lac/PAA-MWCNTs/GEs for O2is 55.8 μmol·L-1and the detection limit of oxygen reaches 0.57 μmol·L-1.After 2 months of storage at 4°Cthe ORR activity of the Lac/PAA-MWCNTs/GC electrode retains ca 86%of its initial values and the peak potential of the ORR shifts negatively by ca 50 mV.Given the excellent catalytic performance towards ORR and its high stability this strategy will be widely applicable to the development of an enzyme-based cathode for biofuel cells and amperometric biosensors for oxygen.

Laccase; Direct electron transfer; Oxygen reduction reaction; Bioelectrocatalysis; Biosensor

O646;O629.8

Received:July 7,2010;Revised:September 3,2010;Published on Web:October 29,2010.

?Corresponding author.Email:yachen@ustc.edu.cn;Tel:+86-551-3601511.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20773116)and National Outstanding Young Scientists Foundation of China(20474060).

國(guó)家自然科學(xué)基金(20773116)和國(guó)家杰出青年基金(20474060)資助項(xiàng)目

?Editorial office ofActa Physico-Chimica Sinica