王廣科,李明春,李晉川,潘渠,何思思,刑來君

(1.成都醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室,四川 成都 610083;2.南開大學(xué)微生物學(xué)系,天津 300071)

·論著·

高山被孢霉Δ6-脂肪酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)化大豆的研究

王廣科1,李明春2,李晉川1,潘渠1,何思思1,刑來君2

(1.成都醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室,四川 成都 610083;2.南開大學(xué)微生物學(xué)系,天津 300071)

目的 從高山被孢霉中克隆的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因與植物表達(dá)載體 pBA121連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pBMACL6,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)成功地將該基因?qū)氲皆耘啻蠖辜?47品種中,獲得一批轉(zhuǎn)基因植株。方法 利用子葉節(jié)外植體誘導(dǎo)出叢生芽和再生植株,利用卡那霉素的抗性篩選培養(yǎng)基連續(xù)篩選以及 PCR方法、DNA分子雜交分析檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因表達(dá)狀況。結(jié)果 經(jīng) PCR檢測(cè)和DNA分子雜交分析,初步證明Δ6-脂肪酸脫氫酶基因已導(dǎo)入并整合到大豆基因組中。結(jié)論 成功地將Δ6-脂肪酸脫氫酶基因?qū)氩⒄系酱蠖够蚪M中。

Δ6-脂肪酸脫氫酶基因;大豆;農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)基因植株

脂肪酸脫氫酶 (fatty acid desaturase)是不飽和脂肪酸合成途徑的關(guān)鍵酶之一,能催化脂肪酸長(zhǎng)鏈的特定位置上脫氫形成雙鍵。在動(dòng)物、植物和微生物等的膜脂中含有特定的不飽和脂肪酸,其不飽和程度由催化不同脫飽和反應(yīng)的脫氫酶所調(diào)節(jié)[1]。因此,脂肪酸脫氫酶在生物膜的形成和物理性質(zhì)、調(diào)節(jié)膜脂中脂肪酸的組成與不飽和度等方面起著決定性的作用[2-5]。

大豆中富含亞油酸,它可以作為Δ6-脂肪酸脫氫酶作用的底物催化生成γ-亞麻酸 (GLA)。本室對(duì)不同來源的 20多種大豆的脂肪酸成分的分析表明：亞油酸含量占脂肪酸總量的 40%以上,最高達(dá)58.3%.現(xiàn)在,國(guó)內(nèi)外報(bào)道的轉(zhuǎn)基因大豆成功的例子很多,如抗除草劑、抗蟲以及抗真菌等,轉(zhuǎn)化方法也比較成熟。本室從高產(chǎn)γ-亞麻酸的高山被孢霉菌株中克隆出Δ6-脂肪酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)基因,是世界上第10個(gè)克隆出該基因的實(shí)驗(yàn)室,在 GenBank中的序列接收號(hào)分別為AF307940,并在酵母和煙草中得到表達(dá)[6-9],為將該基因轉(zhuǎn)化到大豆中提供了前提和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 吉林 47優(yōu)良品種,由吉林省農(nóng)科院大豆研究所提供。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 M ortierella alpinaATCC 16266,本室保存Agrobacterium tum efaciensLBA4404,由中科院微生物所方榮祥院士饋贈(zèng) pGA643 (Kanr),由內(nèi)蒙古大學(xué)哈斯阿古拉教授惠贈(zèng) pTMACL6(Ampr)(全長(zhǎng)MA D6D cDNA),南開大學(xué)真菌實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 UN IQ-10柱式多用途DNA純化試劑盒,dNTPMix,上游引物9651,下游引物w21500均購(gòu)自上海 Sangon公司;限制性內(nèi)切酶,T4DNA連接酶,卡那霉素,利福平和鏈霉素等主要購(gòu)自華美生物工程公司,寶生物公司;地高辛標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó) Roche公司;Taq DNA聚合酶,Taq DNA plus購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;γ-亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自 Sigma公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 LB、YEB培養(yǎng)基見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》;MS及MSB配方見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

1.2.2 抗生素與激素的配制 配制方法見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

1.2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 以重組質(zhì)粒pT MACL-6進(jìn)行 PCR,PCR的產(chǎn)物純化后經(jīng) XbaⅠ和BglⅡ雙酶切獲得高山被孢霉的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因,經(jīng)與 pGA643質(zhì)粒載體連接構(gòu)建出含有Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的 pG MACL-6表達(dá)載體。將該表達(dá)載體經(jīng)電轉(zhuǎn)化到LBA4404根癌農(nóng)桿菌中,并以此菌進(jìn)行東北大豆品種吉林 47的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 農(nóng)桿菌的培養(yǎng) 從保存的農(nóng)桿菌平板上挑取含有表達(dá)載體的單菌落接入含有 50 mg/L Kan、25 mg/L Rif、25 mg/L Str的 YEB培養(yǎng)基中,28℃, 150 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)Δ6-脂肪酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)化大豆。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學(xué)檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因植株 PCR檢測(cè) 取卡那霉素篩選過的轉(zhuǎn)基因植株,用 CTAB法提取總DNA,用于 PCR擴(kuò)增Δ6-脂肪酸脫氫酶基因。

上游引物序列 P1(9651)：5’-GGCTTCTAGAATGGCTGCTGCTCCCAGT-3’(XbaⅠ)下游引物序列 P2 (w21500)：5’-CTGCAGATCTTTACTGCGCCTTACC-3’(BglⅡ)反應(yīng)條件：94℃5 min→94℃1 min→53℃1 min→72℃2 min→35 cycles→72℃10 min.

轉(zhuǎn)基因植株的 Southern檢測(cè) 大量提取 PCR反應(yīng)陽性大豆轉(zhuǎn)基因植株的總 DNA,HindⅢ單酶切后經(jīng)過電泳及轉(zhuǎn)膜步驟后與地高辛標(biāo)記的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的探針雜交,具體步驟見雜交試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒DNA鑒定

對(duì)重組表達(dá)載體 pGAM I CL6進(jìn)行 XbaⅠ和 BglⅡ雙酶切鑒定,可見一條約 1.37 kb的電泳帶 (Δ6-脂肪酸脫氫酶基因約為 1.37 kb),說明目的基因存在,結(jié)果見圖 1.

圖1 重組表達(dá)載體pGMACL6酶切鑒定Fig.1 Restriction analysis of recomb inant expression vectors pGAM I CL6/MACL61.pG M ICL6/XbaⅠ+BglⅡ;2.pGA643/XbaⅠ+BglⅡ;3.λDNA/ HindⅢMarker;4.D6D PCR product

2.2 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與鑒定

采用液氮凍融法將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pGAMACL6轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 LBA4404,然后再含有125 mg/LStr、25 mg/Lrif和 100 mg/Lkan的 YEB選擇培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng) 48 h后出現(xiàn)白色菌落。采用菌落 PCR法鑒定農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化子。電泳檢測(cè)表明它們的 PCR產(chǎn)物大小一致,均為 1.37 kb,從而可以證明本試驗(yàn)構(gòu)建的植物表達(dá)載體 pGAMACL6已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。PCR檢測(cè)結(jié)果如圖 2.

圖2 PCR鑒定農(nóng)桿菌中的D6D基因Fig.2 Identification of D6D genes in Agrobacterium tumefaciens by PCR1.pG M ICL6;2 DL2000 Marker;3 pG MACL6.

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化

在子葉節(jié)外植體獲得后,轉(zhuǎn)移到預(yù)培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24-36 h,然后進(jìn)行農(nóng)桿菌的感染。同時(shí)以未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)基培養(yǎng)和在預(yù)培養(yǎng)基培養(yǎng) 140 h的子葉節(jié)誘導(dǎo)從生芽進(jìn)行比較可知：未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)基培養(yǎng)的子葉節(jié)要比經(jīng)過預(yù)培養(yǎng) 24-36 h的子葉節(jié)推遲 3-5 d左右出現(xiàn)從生芽。將子葉節(jié)預(yù)培養(yǎng) 140 h,則子葉節(jié)誘導(dǎo)叢生芽率會(huì)急劇下降(如表 1)。原因可能是短時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)有助于切口細(xì)胞進(jìn)入傷口修復(fù)反應(yīng),產(chǎn)生一定數(shù)量的愈傷,而長(zhǎng)時(shí)間的在誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng),阻礙了細(xì)胞進(jìn)一步分化生長(zhǎng),并加快了細(xì)胞的老化及褐化過程,因而使誘導(dǎo)叢生芽率不斷下降。

表1 預(yù)處理對(duì)大豆叢生芽誘導(dǎo)的影響Tab.1 The effect of pretreatment on induction of multiple shoot of soybean

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學(xué)檢測(cè)分析

2.4.1 轉(zhuǎn)基因植株的 PCR檢測(cè) 以 CTAB法提取大豆轉(zhuǎn)化抗性再生苗 (T0代)和 T1代葉片中的總DNA,以材料和方法中的 PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增,電泳檢測(cè)。結(jié)果在 33棵吉林 47抗性再生植株中,擴(kuò)增出了約 1.4 kb的目的帶,而未轉(zhuǎn)化的對(duì)照則無此目的帶,PCR陽性率為 65.12%.實(shí)際轉(zhuǎn)化率為 1. 03%.見圖 3.

2.4.2 轉(zhuǎn)基因植株的斑點(diǎn)雜交分析 提取 PCR檢測(cè)陽性的轉(zhuǎn)基因植株葉片的總DNA,與Δ6-脂肪酸脫氫酶基因探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交檢測(cè),結(jié)果 PCR表現(xiàn)陽性的樣品,在斑點(diǎn)雜交中均表現(xiàn)為陽性,雜交斑點(diǎn)清晰,見圖 4.

3 討論

3.1 影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化率的因子

3.1.1 無菌苗的培養(yǎng)時(shí)間 無菌苗的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)于大豆子葉節(jié)的遺傳轉(zhuǎn)化也有很大影響。本實(shí)驗(yàn)分別采用培養(yǎng) 2天、4天、6天和 8天的無菌苗作為實(shí)驗(yàn)材料,切除其子葉節(jié)外植體經(jīng)農(nóng)桿菌感染后誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化芽,結(jié)果發(fā)現(xiàn)從培養(yǎng) 4天的無菌苗上切除的子葉節(jié)外植體轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)率較高,這和構(gòu)建再生體系時(shí)的結(jié)論一致。選擇 5天以上苗齡的子葉節(jié)表現(xiàn)為：抗性再生苗少,再生苗 PCR陽性率較低,即獲得的抗性植株嵌合體較多,可能是以這些苗齡的子葉節(jié)為外植體轉(zhuǎn)化時(shí),側(cè)芽開始生長(zhǎng),而使再分化芽生長(zhǎng)受到抑制,如將已長(zhǎng)出的側(cè)芽切掉,切口處則生成愈傷組織,但誘導(dǎo)叢生芽困難。

3.1.2 農(nóng)桿菌菌株 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力與農(nóng)桿菌菌

株[10]有關(guān)。王連錚等利用致癌農(nóng)桿菌的 15個(gè)菌系對(duì) 2759個(gè)大豆品種的致癌作用進(jìn)行了研究,篩選出7個(gè)致瘤能力較強(qiáng)的菌系,致瘤效果較好的菌株為B3/73、C58、A208.李洪泉等用根癌農(nóng)桿菌 chry5對(duì)我國(guó) 10個(gè)大豆栽培品種子葉的致瘤作用進(jìn)行了研究,結(jié)果對(duì) 7個(gè)品種上致瘤率作用比我國(guó)的超毒菌株A281還強(qiáng),對(duì)所有品種的致瘤率高于 T37,說明不同農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化能力差異很大。本實(shí)驗(yàn)采用根癌農(nóng)桿菌LBA4404,該菌株廣泛應(yīng)用于大豆的遺傳轉(zhuǎn)化中。根癌農(nóng)桿菌通常用 YEB培養(yǎng)液活化后,再感染外植體。農(nóng)桿菌活化時(shí)間以及感染時(shí)農(nóng)桿菌的菌農(nóng)對(duì)轉(zhuǎn)化率都有一定的影響,一般而言,農(nóng)桿菌在活化 30小時(shí)左右為最佳感染時(shí)間,此時(shí)農(nóng)桿菌的感染能力最強(qiáng)。

3.1.3 感染時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)主要采用浸泡的方法來感染外植體,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：感染時(shí)間以 15～20分鐘為宜,時(shí)間較短會(huì)使轉(zhuǎn)化率降低,而時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使外植體易黃化或褐化,影響芽的誘導(dǎo)。另外,實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)感染時(shí)人為制造傷口的轉(zhuǎn)化效果優(yōu)于未造成傷口的轉(zhuǎn)化效果。

3.1.4 酚類化合物 AS 酚類化合物乙酰丁香酮(AS)等對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力有明顯影響。國(guó)外 Annette等報(bào)道乙酰丁香酮利于提高大豆的轉(zhuǎn)化效率,國(guó)內(nèi)許躍和李寶鍵實(shí)驗(yàn)也證明,多酚化合物或用對(duì)農(nóng)桿菌敏感的植物提取物處理農(nóng)桿菌,誘導(dǎo) Vir區(qū)基因活化,增加農(nóng)桿菌在培養(yǎng)植物細(xì)胞上的附著[11,12]。本實(shí)驗(yàn)也表明：農(nóng)桿菌感染后共培養(yǎng)時(shí)加入 100 suM/L的乙酰丁香酮對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力有明顯的提高,促進(jìn)根癌農(nóng)桿菌對(duì)外植體的高效轉(zhuǎn)化。

3.2 影響抗性再生苗生根的因子

3.2.1 轉(zhuǎn)化苗的生長(zhǎng)情況 轉(zhuǎn)化苗在加有 GA3的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中,實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)轉(zhuǎn)化苗在伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中長(zhǎng)到3～4 cm長(zhǎng)時(shí)轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中最利于生根。過矮會(huì)使抗性苗在生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢,以造成抗性苗的矮化;過高會(huì)使抗性苗易老化,在生根之前就死亡。

3.2.2 抗生素及激素 本實(shí)驗(yàn)的生根培養(yǎng)基中已去除了抑制細(xì)菌的頭孢霉素,抗性壓力也有所緩解,卡那霉素由分化培養(yǎng)基中的50 mg/L降為25 mg/L.對(duì)于激素而言,不加 6-芐氨基嘌呤 (6-BA),3-吲哚丁酸( IBA)由 0.2 mg/L升高到 1.5 mg/L.

3.2.3 蛭石和生根粉 抗性再生苗在生根培養(yǎng)基中長(zhǎng)出主根后,轉(zhuǎn)入蛭石中。由于蛭石良好的透氣性,有利于主根的生長(zhǎng)和大量側(cè)根的形成。另外,使用生根粉利于根的生長(zhǎng)。

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The Study on Transformation ofΔ6-Fatty Acid Desaturase Genes fromM ortierella alpine into Soybean

WANG Guang-ke1,LIM ing-chun2,LI Jin-chuan1,PAN Qu1,HE Si-si1,XING Lai-jun2.
(1.Chengdu M edical College,Chengdu,Sichuan610083,China;2.Depar tm ent of M icrobiology,Nankai University,Tianjin 300071,China)

Objective To introduceΔ6-fatty acid desaturase genes fromM ortieralla alpinainto jilin47 via Agrobacterium infection method,adentitious,and obtain transgenic plants.M ethods Adentitious buds and regenerated plants were induced from cotyledon nodes and screened continuously in kanamycin resistant culture medium.PCR and Southern blot were used to detect expression of theΔ6-fatty acid desaturase genes in transgenic plants.Results PCR and Southern blot analysis from transgenic plantsproved that theΔ6-fatty acid desaturase geneswere transferred and integrated into soybean genome.Conclusion TheΔ6-fatty acid desaturase genes are transferred and integrated into soybean genome successfully.

Δ6-fatty acid desaturase gene;Soybean(Glycin max L);Agrobacterium-mediated transforma tion;transgenic plant

Q943.2;Q949.751.9

A

1674-2257(2010)02-093-04

10.3969/j.issn.1674-2257.2010.02.001

2010-03-03

2010-03-13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：30200176)

王廣科(1976-),男,安徽省淮北市人,博士,主要從事腫瘤治療和愛滋病毒疫苗的研究,電話：13668172093