胡青平

(山西師范大學(xué)生命學(xué)院,臨汾 041004)

產(chǎn)纖維素酶細菌菌株 Z1發(fā)酵條件優(yōu)化

胡青平

(山西師范大學(xué)生命學(xué)院,臨汾 041004)

以本實驗室分離的產(chǎn)纖維素酶細菌菌株 Z1為研究對象,采用單因素試驗、正交試驗、方差分析和多重比較,研究了碳源、氮源、溫度、初始 pH等因素對 Z1菌株產(chǎn)纖維素酶活力的影響,確定了其產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)條件組合。結(jié)果表明,在此試驗范圍內(nèi),影響 CMC酶的主次因素由大到小依次為碳源、氮源、pH;影響FPA酶的主次因素由大到小依次為 pH、碳源、氮源。菌株 Z1的最優(yōu)發(fā)酵條件為 CMC 2 g,玉米粉 1 g,豆餅粉3 g,pH為 7.0。在此條件下,不僅有較高的纖維素酶活,同時還有較高的蛋白酶活,即 CMC酶活力 132.5 μg/(mL·min),FPA酶活力 93.8μg/(mL·min),蛋白酶活力 46.7μg/(mL·min)。

纖維素酶 細菌 發(fā)酵條件

纖維素酶是降解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵,使纖維素分解成纖維二糖、葡萄糖等可溶性糖的一組酶的總稱。該酶己在紡織、日用化工、造紙、食品發(fā)酵加工工業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用,并受到各國生物界的關(guān)注,期望借助纖維素酶將地球上最廉價、最豐富的可再生資源 -纖維素,轉(zhuǎn)化為能直接利用的能源和資源[1-5]。目前纖維素資源的利用率不僅低,而且對環(huán)境會造成一定的污染。因此,如何成功的開發(fā)這一資源,對解決人類面臨的能源問題、環(huán)境問題、可持續(xù)發(fā)展都具有非常重要的意義[6]。

利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶來分解和轉(zhuǎn)化纖維素則是纖維素利用的有效途徑[7]。一直以來,纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)都以真菌為主。但真菌纖維素酶的適宜 pH值多為酸性,工業(yè)應(yīng)用步驟繁瑣,在很大程度影響了纖維素的酶解效率[8-9]。近年來,隨著細菌產(chǎn)生的中性和堿性纖維素酶在工業(yè)中的成功應(yīng)用,細菌纖維素酶制劑已逐漸成為關(guān)注的熱點。但細菌產(chǎn)纖維素酶的產(chǎn)量較少,主要是葡聚糖內(nèi)切酶,大多數(shù)對結(jié)晶纖維素?zé)o降解活性,且所產(chǎn)生的酶大多是胞內(nèi)酶或吸附在細胞壁上,不分泌到培養(yǎng)液中,增加了提取純化的難度,因此對細菌的研究較少。本試驗的研究對象是從自然環(huán)境中分離、純化和培養(yǎng)了的一株經(jīng)剛果紅顯色法鑒定的高效纖維素分解細菌菌株 Z1,同時還有產(chǎn)蛋白酶的性能。采用正交設(shè)計和統(tǒng)計分析相結(jié)合,優(yōu)化了 Z1菌株的發(fā)酵條件,為進一步的生產(chǎn)實踐應(yīng)用提供可能的發(fā)酵模式和新的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

山西師范大學(xué)微生物實驗室分離的一株產(chǎn)纖維素酶細菌菌株,該菌形態(tài)桿狀,可產(chǎn)芽孢,適宜在 pH值 7.0～9.0、35～40℃條件下生長,為便于研究,將其命名為 Z1。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 菌種保藏培養(yǎng)基 (g/L)[10]

蛋白胨 10 g,牛肉膏 3 g,NaCl 1 g,瓊脂 20 g,pH為 7.0,121℃滅菌 20 min。

1.2.2 CMC-剛果紅分離培養(yǎng)基 (g/L)[11]

CMC-Na 1.88 g,剛果紅 0.2 g,硫酸銨 3 g,瓊脂 20 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NaCl 0.5 g,K2H PO41 g,pH為 7.0,121℃滅菌 20 min。

1.2.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)[10]

CMC 3.0 g,蛋白胨 5 g,NaCl 0.5 g,KH2PO40.1 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,酵母粉 5 g,pH為 7.0, 121℃滅菌 20 min。

1.3 主要儀器與設(shè)備

HPX-9272數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱:上海博迅實業(yè)有限公司;BS-2F數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱:常州菲普實驗儀器廠;7200可見分光光度計:龍尼柯儀器有限公司。

1.4 菌株 Z1產(chǎn)纖維素酶能力定性分析

將實驗室已分離的纖維素酶菌 Z1三點接種于CMC-剛果紅分離培養(yǎng)基,在 35℃的培養(yǎng)箱里放置3 d。觀察透明圈的有無和大小。

1.5 產(chǎn)纖維素酶的條件優(yōu)化

分別改變液體發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源 (玉米粉、CMC)、氮源(豆餅粉、蛋白胨),并以兩種碳源的復(fù)配克數(shù) (3.0+0、2.0+1.0、1.5+1.5、1.0+2.0、0+ 3.0 g/L)、豆餅粉 (1、3、5、7、9 g/L)、發(fā)酵溫度 (25、30、32、35、37、40℃)和初始 pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)為 4個單因素試驗,搖床培養(yǎng) 72 h。測定各單因素條件下初酶液的CMC酶活力和 FPA酶活。然后選擇其中三個因素 (碳源、氮源和 pH),采用L9(34)正交實驗[12],以 CMC酶、FPA酶及蛋白酶活為衡量指標,研究三因素對產(chǎn)酶的主次影響。統(tǒng)計分析軟件為DPS v3.01。

1.6 初酶液的制備

液體發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng) 35℃,220 r/min搖床培養(yǎng)72 h,發(fā)酵液用 4層紗布過濾,3 000 r/min離心15 min,取上清液備用。

1.7 纖維素酶活測定

CMC酶活力和 FPA酶活力的測定均用 DNS法[9],包括葡萄糖標準曲線的制作。另 CMC酶作用底物用CMC-Na,FPA酶作用底物為濾紙條。酶活力定義參照國家行業(yè)標準QB 2583—2003。

1.8 蛋白酶活測定

參照丁魯華等[13]測定蛋白酶活力的方法。1.0 mL酶液于40℃,pH 7.2條件下,每分鐘水解2%酪蛋白溶液產(chǎn)生1 g酪氨酸的量定義為一個酶活力單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株 Z1產(chǎn)纖維素酶能力的定性分析

圖1 產(chǎn)纖維素酶菌株的定性分析

將 Z1菌株接種于剛果紅培養(yǎng)基上培養(yǎng),結(jié)果見圖 1。由于剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物,而不能與水解后的纖維二糖和葡萄糖形成紅色復(fù)合物,所以在產(chǎn)纖維素酶菌株周圍會出現(xiàn)透明圈,通過測量其透明圈的直徑(1.7±0.4)cm。故 Z1是一株產(chǎn)纖維素酶的細菌菌株。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗

分別改變 Z1菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源、初始培養(yǎng) pH和發(fā)酵溫度,控制其他條件不變,搖床培養(yǎng) 72h。各處理的纖維素酶活力見表 1、圖 2、圖3、圖 4和圖 5。

表1 碳、氮源對產(chǎn)纖維素酶活的影響

從表1可知,各處理中 CMC酶活力均高于 FPA酶活,且玉米粉和CMC對 CMC酶活力和 FPA酶活力的影響均無顯著差異(P>0.05),而纖維素酶屬誘導(dǎo)酶,故在后續(xù)試驗中考慮用玉米粉和 CMC的復(fù)配提高纖維素酶活;豆餅粉和蛋白胨對纖維素酶活的影響也無顯著性差異 (P>0.05),為了低成本、更有效的服務(wù)于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn),故選用豆餅粉為氮源。

從圖 2可知,CMC和玉米粉復(fù)配對纖維素酶活有一定的影響,其復(fù)配克數(shù)為 (2+1)g/L時,CMC酶活力和FPA酶活力都達到最高;從圖 3可知,當豆餅粉為 5 g/L時,有較高的 CMC酶活力和 FPA酶活力;從圖 4可知,初始 pH為 6.5～7.5時, CMC酶活力較高,初始 pH為 7.0,FPA酶活力最高;從圖 5可知,小范圍的溫度變化會引起纖維素酶的大幅度變化,因此,在后續(xù)正交試驗中,固定發(fā)酵溫度為 35℃。

2.2.2 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上,保持發(fā)酵溫度不變(35℃),采用 L9(34)正交試驗的方法,研究氮源 (豆餅粉)、CMC和玉米粉的復(fù)配比例、pH三個因素對產(chǎn)纖維素酶和產(chǎn)蛋白酶的影響。確定其發(fā)酵的主次因素及相互關(guān)系。試驗結(jié)果及統(tǒng)計分析見表 2、表 3和表4。

表2 菌株 Z1正交試驗

表3 方差分析

從表2中極差R可知,以 CMC酶活力為衡量指標時,各因素的主次順序及最優(yōu)組合為:B2A2C2,且各處理的 CMC酶活力間沒有顯著性差異 (P> 0.05)。以 FPA酶活力為衡量指標時,各因素的主次順序及最優(yōu)組合為:C2B2A1,且各處理的 FPA酶活力間有顯著性差異(P<0.05),說明各因素的水平間不能相互替換。以蛋白酶活為衡量指標時,各因素的主次順序為:B2A2C2,且各處理的蛋白酶活沒有顯著性差異(P>0.05)。從表 3方差分析和表 4的 SSR多重比較得知,B因素的三水平對三種酶活力的影響均有顯著性差異 (P<0.05),而 C因素的水平只對FPA酶活力有顯著性差異 (P<0.05)。綜合以上分析,首先可以確定的因素水平為 C2B2。對于A因素,對于CMC酶活力和蛋白酶活來說,需選2水平,但考慮到降低成本,我們選用A因素的 1水平,且B2C2A1組合下發(fā)酵的三類酶活力均處于較高的水平,即 CMC 2 g,玉米粉 1 g,豆餅粉 3 g,pH為 7.0的條件下發(fā)酵時,CMC酶活力 132.5μg/(mL·min),FPA酶活力93.8μg/(mL·min),蛋白酶活力 46.7μg/(mL· min)。

表4 SSR檢驗

3 結(jié)論

主要研究了不同氮源、碳源、不同初始 pH及不同發(fā)酵溫度對菌株 Z1產(chǎn)纖維素酶活的影響,并通過L9(34)正交試驗得出了最優(yōu)發(fā)酵條件組合,即 CMC 2 g,玉米粉 1 g,豆餅粉 3 g,pH為 7.0的條件下發(fā)酵時,CMC酶活力 132.5μg/(mL·min),FPA酶活力93.8μg/(mL·min),蛋白酶活力 46.7μg/(mL·min)。試驗所確定的 Z1菌株的最優(yōu)條件組合可以為該菌株的規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶蛋白酶提供了一定的理論依據(jù)。

[1]Baker R A,W icker L.Current and potential applications of enzyme infusion in the food industry[J].Trends Food Science Technology,1996,7(9):279-284

[2]劉翔,何國慶.纖維素酶及相關(guān)酶在食品生物技術(shù)中的應(yīng)用[J].糧油加工與機械,2003,6:61-63

[3]閆訓(xùn)友,劉志敏,史振霞,等.纖維素酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用進展[J].食品工業(yè)科技,2004,25(10):140-142

[4]邱雁臨.纖維素酶的研究和應(yīng)用前景 [J].糧食與飼料工業(yè),2001,8:30-31

[5]陳春嵐,李楠.細菌纖維素酶研究進展[J].廣西輕工業(yè), 2007,1:18-20

[6]Lynd L R,Weimer P J,VanzylW H,et al.Micribial cellulose utilization:Fundamental sand biotechnology[J].Microbiolo2 gy and molecular biology reviews,2002,66(3):506-577

[7]謝占玲,吳潤.纖維素酶的研究進展[J].草業(yè)科學(xué),2004, 4(4):72-76

[8]馬旭光,張宗舟,藺海明,等.黑曲霉高產(chǎn)纖維素酶活突變株的篩選[J].中國釀造,2008,9:61-63

[9]趙玉萍.稻殼對綠色木霉產(chǎn)纖維素酶的影響[J].中國糧油學(xué)報,2006,21(6):18-21

[10]謝小保,譚宏,黃小茉,等.黑曲霉 GD-6纖維素酶液體發(fā)酵條件的研究[J].微生物學(xué)雜志,2004,24(2):21-23

[11]葉姜瑜.一種纖維素分解鑒別培養(yǎng)基 [J].微生物學(xué)通報,1997,24(4):251-252

[12]封曄,來航線,鄭真.高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2007,10:133-138

[13]丁魯華,孫淑琴.蛋白酶活性的快速準確測定方法[J].食品與發(fā)酵工業(yè),1984(4):25-28.

Opti mization of Fer mentation Conditions for Cellulase High-Yield Bacteria Z1

Hu Qingping
(College ofLife Science,ShanxiNormalUniversity,Linfen 041004)

Taking cellulase high-yield strain Z1 from our laboratory as object,the fermentation conditions for strain Z1were optimized.Single factor tests,orthogonal experimental designs,variance analysis and multiple comparisonswere applied to study the effects of influencing factors,carbon source,nitrogen source,temperature and pH,and to op2 timize the fermentation parameters.Results:The effect sequences of three main factors for CMC enzyme activity rank from pri mary to secondary as carbon source,nitrogen source,and pH,and for FPA enzyme activity as pH,carbon source,and nitrogen source.The optimal fer mentation conditions for strain Z1 are CMC 2 g,corn flour 1 g,soybean meal powder 3 g,pH 7.0.Under the optimal fer mentation conditions,strain Z1 has not only high cellulase activity but also high protease activity,i.e.,C MC enzyme activity 132.5μg/(mL·min),FPA enzyme activity 93.8μg/(mL·min) and protease activity 46.7μg/(mL·min).

cellulase,bacteria,fermentation conditions

Q939.97 文獻標識碼:A 文章編號:1003-0174(2010)09-0111-05

山西省青年基金 (2008021040),山西省軟科學(xué)項目(2010041031-02),山西師范大學(xué)自然基金 (ZR0 9015)

2009-07-15

胡青平,女,1972年出生,博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,微生物資源開發(fā)應(yīng)用