劉青梅胡慶松,楊性民郁志芳

(浙江萬里學(xué)院 寧波市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1,寧波 315100)

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)系2,南京 219500)

響應(yīng)面法優(yōu)化年糕抑菌保鮮劑的研究

劉青梅1胡慶松1,2楊性民1郁志芳2

(浙江萬里學(xué)院 寧波市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1,寧波 315100)

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)系2,南京 219500)

采用響應(yīng)面法(RS M)分析了乳酸鏈球菌素、丙酸鈣、乳酸和殼聚糖對(duì)年糕腐敗菌生長的抑制作用,以探討抑菌劑對(duì)年糕的保鮮效果。結(jié)果表明:乳酸鏈球菌素和乳酸對(duì)年糕保鮮的抑菌作用極為顯著,二者的交互影響作用也極為顯著;丙酸鈣對(duì)年糕中霉菌的抑制作用較好。殼聚糖濃度影響抑菌劑成膜的厚薄,從而影響到抑菌效果。通過中心組合設(shè)計(jì)(CCD)試驗(yàn)設(shè)計(jì)并建立回歸模型,經(jīng)驗(yàn)證回歸的擬合程度好。同時(shí)得出年糕復(fù)合抑菌劑配方為殼聚糖 2%、乳酸 1%、乳酸鏈球菌素 0.30 g/L、丙酸鈣 0.3 g/L,采用該抑菌保鮮液涂膜處理年糕,真空包裝后 25℃貯藏 120 d無變質(zhì),菌落總數(shù)測定 <1 000 cfu/g。

年糕 響應(yīng)面分析 抑菌劑

年糕 (rice cake)是以粳米為原料,經(jīng)浸泡、水磨、壓榨、蒸煮、擠壓成型等工序加工而成的一種傳統(tǒng)食品,具有爽滑、香糯的優(yōu)良品質(zhì),深受消費(fèi)者歡迎。由于年糕是水分含量高,水分活度大的低酸性淀粉制品,很容易因細(xì)菌、霉菌和酵母等微生物污染引起年糕腐敗變質(zhì)。外貿(mào)出口年糕采用真空包裝、高溫高壓滅菌技術(shù)解決年糕保質(zhì)的問題,雖然年糕經(jīng)高溫高壓滅菌,可達(dá)到商業(yè)無菌,保質(zhì)期得到了延長,但年糕色澤變黃、質(zhì)地變硬,難以保持原有的質(zhì)地和色澤,可謂保質(zhì)而不保鮮。內(nèi)銷年糕采用常壓滅菌(95～100℃,30～50 min),由于滅菌不徹底,容易因細(xì)菌、霉菌繁殖而發(fā)霉變質(zhì),保質(zhì)期短。有些年糕加工企業(yè)仍使用國家禁止的亞硫酸鈉來抑制年糕微生物[1]。

本課題組在對(duì)年糕保鮮研究中發(fā)現(xiàn),年糕的腐敗菌僅生長在年糕表面。因此,試驗(yàn)采用殼聚糖(chitosan)作為載體[2],將對(duì)人體無毒副作用的天然防腐劑乳酸、乳酸鏈球菌素 (Nisin)和丙酸鈣在年糕表面涂膜,形成一層防腐保鮮膜,抑制腐敗微生物生長繁殖。

乳酸鏈球菌素是國際上公認(rèn)安全的防腐劑,是乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種多肽物質(zhì),具有較強(qiáng)殺菌作用的天然代謝產(chǎn)物,能殺死或抑制革蘭氏陽性菌,特別是細(xì)菌孢子,金黃葡萄球菌、溶血鏈球菌、肉毒梭菌等[3-5]。

丙酸鈣對(duì)霉菌、酵母菌等具有廣泛的抗菌作用?？捎米魇称贩烂箘?用于面包及糕點(diǎn)的最大使用量為 2.5 g/kg[6]。

乳酸作為天然的酸味調(diào)節(jié)劑,在面包、蛋糕、餅干等焙烤食品用于調(diào)味和抑菌作用,并能改進(jìn)食品的品質(zhì),延長保質(zhì)期[7]。

響應(yīng)面法(RS M)試驗(yàn)設(shè)計(jì),是采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,通過對(duì)回歸方程的分析來尋求最佳的工藝參數(shù),解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方式。目前越來越多人采用響應(yīng)面法來優(yōu)化工藝參數(shù)、優(yōu)化抑菌劑配比[8-9]。本試驗(yàn)應(yīng)用響應(yīng)面法(RS M)設(shè)計(jì),采用 design expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,篩選出一種能明顯抑制年糕腐敗的復(fù)合抑菌劑,在年糕生產(chǎn)上具有十分重要的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

年糕:余姚市河姆渡統(tǒng)一精制年糕廠;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基:杭州微生物試劑有限公司;乳酸鏈球菌素 (純度50%):中國銀象生物工程有限公司出品;丙酸鈣:中國鄭州銀河食品添加劑有限公司出品;殼聚糖(脫乙酰度 90%):濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司;L-乳酸(食品級(jí)):鄭州天潤乳酸有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S W-CJ-I B(u)型超凈工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備有限公司;LDZX-30KB/KBS型高壓蒸汽滅菌鍋:寧波江南儀器廠;SPX型智能生化培養(yǎng)箱:寧波江南儀器廠;JLQ-S1型菌落計(jì)數(shù)器:江蘇錫山市金城儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸鏈球菌素對(duì)年糕中細(xì)菌抑制作用的試驗(yàn)

取 1%的殼聚糖溶解在 1%的乳酸溶液中,加入 0.6 g/L丙酸鈣,再在上述溶液中分別配制 0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.20、0.30 g/L的乳酸鏈球菌素溶液。將上述保鮮液分別浸涂在年糕表面,每個(gè)處理重復(fù) 10次,待涂膜的保鮮液干后,用薄膜袋包裝封口,于 25℃恒溫箱中放置 5 d,隨機(jī)抽出 3塊年糕(25 g/塊)測細(xì)菌菌落總數(shù),分析乳酸鏈球菌素對(duì)年糕中細(xì)菌的抑制效果。

1.3.2 丙酸鈣對(duì)年糕中真菌抑制作用的試驗(yàn)

取 2%的殼聚糖溶解在1%的乳酸溶液中,加入0.30 g/L的乳酸鏈球菌素,在該溶液中分別配制0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.040、0.080、0.100、0.200、0.300 g/L的丙酸鈣配制成保鮮液。將上述保鮮液浸涂在年糕表面,每個(gè)處理重復(fù) 10次,待浸涂的保鮮液干后,用薄膜袋包裝封口,于25℃恒溫箱中放置 5 d,計(jì)算這 10塊年糕中的霉菌菌斑總數(shù),分析丙酸鈣對(duì)年糕中真菌的抑制效果。

1.3.3 乳酸處理對(duì)年糕中微生物的影響

乳酸對(duì)微生物的影響十分顯著,其對(duì)微生物的抑制作用主要是通過降低 pH殺菌和通過自身結(jié)構(gòu)對(duì)微生物生長的影響。

在含水量約40%的米粉中添加2%的乳酸溶液,米粉的 pH調(diào)節(jié)值為 2、3、4、5、6,蒸煮并擠壓成型后,按 25 g/袋真空包裝后貯藏,分析酸化對(duì)年糕中微生物的抑制效果。

1.3.4 復(fù)合抑菌劑對(duì)年糕中細(xì)菌抑制作用的響應(yīng)面試驗(yàn)

應(yīng)用響應(yīng)面法(RS M)原理,采用中心組合(Cen2 tral Composite Design)設(shè)計(jì) (即 CCD設(shè)計(jì)),可減少正交方法設(shè)計(jì)所需要的試驗(yàn)次數(shù),并縮短試驗(yàn)周期,而且可以通過響應(yīng)面圖和等高線圖,直觀的得到其所需要的水平。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果并參考文獻(xiàn)經(jīng)驗(yàn)值,試驗(yàn)選取對(duì)年糕細(xì)菌抑制作用的殼聚糖、乳酸、乳酸鏈球菌素 3個(gè)因素為自變量,每個(gè)因素取 5個(gè)水平,以(-1.68,-1,0、1、1.68)編碼,以抑菌率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素水平編碼見表 1。

試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用 design expert(version6.0 Stat-Ease Ince,Minneapolis,MN,USA)軟件對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),分析復(fù)合抑菌劑對(duì)年糕中細(xì)菌的抑制效果,并換算為抑菌率。

表1 試驗(yàn)因素水平編碼表

1.4 檢測方法

菌落總數(shù)的測定:按國標(biāo) GB/T4789.2—2003稀釋涂布法;霉菌總數(shù)的測定:測定采用目測法,以年糕表面的霉菌菌斑總數(shù)計(jì)數(shù)。

抑菌率 =lg cfu/g細(xì)菌

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乳酸鏈球菌素對(duì)年糕中細(xì)菌的抑制效果

乳酸鏈球菌素對(duì)年糕中細(xì)菌抑制作用的試驗(yàn)效果,見圖1。

圖 1 不同乳酸鏈球菌素質(zhì)量濃度對(duì)年糕表面細(xì)菌抑制的影響

由圖 1可以看出,乳酸鏈球菌素質(zhì)量濃度對(duì)年糕表面的細(xì)菌有較明顯的抑制效果,兩者呈正相關(guān)系,即質(zhì)量濃度越高抑制效果越好;當(dāng)乳酸鏈球菌素質(zhì)量濃度 >0.2 g/L時(shí),乳酸鏈球菌素對(duì)細(xì)菌的抑制作用不明顯。

2.1.2 丙酸鈣對(duì)年糕中霉菌的抑制作用

為提高對(duì)年糕的霉菌抑制效果,試驗(yàn)在復(fù)合細(xì)菌抑制液 (2%殼聚糖,1%乳酸,0.30 g/L乳酸鏈球菌素)中,加入不同量的丙酸鈣,浸涂處理后在 25℃下放置 5 d,觀測丙酸鈣對(duì)年糕的霉菌抑制效果,結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度丙酸鈣對(duì)霉菌抑制的影響

從圖 2可見,隨著丙酸鈣質(zhì)量濃度的增加,年糕中的霉斑數(shù)有明顯的下降,當(dāng)丙酸鈣質(zhì)量濃度>0.3 g/L時(shí),無霉斑產(chǎn)生。

2.1.3 乳酸對(duì)年糕中細(xì)菌和真菌的抑制效果

乳酸對(duì)對(duì)年糕中細(xì)菌和真菌的抑制效果,是通過降低 pH和自身結(jié)構(gòu)對(duì)微生物生長的影響。pH對(duì)年糕中細(xì)菌和真菌的抑制作用,見圖 3和圖 4。

由圖 3和圖 4可見,pH對(duì)微生物的抑制作用明顯,另外 pH越低,抑制越明顯,當(dāng) pH為 2時(shí),37℃貯藏 16 d細(xì)菌和真菌菌落總數(shù)均 <1×103,但是 pH過低,對(duì)年糕的品質(zhì)會(huì)造成影響。

2.2 復(fù)合抑菌劑對(duì)年糕中細(xì)菌抑制作用的影響

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

試驗(yàn)對(duì)年糕細(xì)菌抑制作用的主要因素(殼聚糖、乳酸、乳酸鏈球菌素)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),應(yīng)用 de2 sign6.0相應(yīng)的 CCD設(shè)計(jì),對(duì)抑菌率數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果見表2。

表2 CCD設(shè)計(jì)方案及抑菌率的測定值

利用Design Expert軟件對(duì)表 2中的響應(yīng)值進(jìn)行二元回歸擬合,確立如下回歸方程預(yù)測模型:Y=0.57 +0.015A+0.070B+0.12C-0.13AA-0.10BB-0.031CC+0.016AB+0.029AC+0.064BC

對(duì)模型進(jìn)行回歸分析,結(jié)果見表 3。

表3 回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)

從表 3結(jié)果表明:

1)該抑菌劑回歸模型 P值為 0.000 1(P<0.01)表示回歸模型指標(biāo)顯著;并且模型的 R2=0.967 9也說明回歸模型的擬合程度較好,僅有約 3.3%微生物生長數(shù)量不能由該模型解釋。從失擬項(xiàng)也可看出,失擬項(xiàng)的 P值為 0.050 8(P>0.05)表明不顯著,說明試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷氖M度好。

2)回歸方程分析:二次項(xiàng) AA和 BB的 P值均<0.01,具有極高的顯著性,說明響應(yīng)值的變化相對(duì)復(fù)雜,各個(gè)試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系,曲面效應(yīng)顯著。一次項(xiàng) B和 C的 P值均<0.01,說明乳酸、乳酸鏈球菌素對(duì)抑菌率影響極顯著,A項(xiàng) P>0.05,說明殼聚糖對(duì)抑菌率影響不顯著。交互項(xiàng)BC的 P<0.01,說明乳酸鏈球菌素和乳酸的交互影響極顯著;交互項(xiàng) AB和 AC的 P值均 > 0.05,說明殼聚糖與乳酸的交互和殼聚糖與乳酸鏈球菌素的交互影響不顯著。

2.2.2 響應(yīng)面和等高線分析 (RSA)

根據(jù)回歸分析結(jié)果(表3)作出相應(yīng)的曲面圖,結(jié)果見圖 5至圖7。

圖 7 Y=f(B,C)的響應(yīng)面(A=2.0)

從圖 5可見:等高線圖為圓形形狀,表明乳酸和殼聚糖的交互作用不顯著,因?yàn)榈雀呔€圖的形狀可以反映出交互作用的強(qiáng)弱,橢圓表示 2個(gè)因素作用顯著,圓形則相反[8]。

從圖 6可見:等高線曲率較小,形狀近似橢圓,說明殼聚糖和乳酸鏈球菌素的相互影響較顯著。在乳酸鏈球菌素含量一定時(shí),抑菌率隨著殼聚糖增加而增加,當(dāng)殼聚糖含量增加到一定程度后,抑菌率反而下降。這是因?yàn)槿樗徭溓蚓匾志鷻C(jī)理與成膜的效果有關(guān),當(dāng)殼聚糖含量過少時(shí),年糕表面不能完整成膜,這樣乳酸鏈球菌素不能很好地在年糕表面成膜,降低了抑菌的作用;若殼聚糖濃度過大,導(dǎo)致膜厚度的增加,與年糕表面接觸的乳酸鏈球菌素濃度的相對(duì)下降,反而降低了抑菌效果。

從圖 7可見,等高線曲率較小,形狀近似橢圓,說明乳酸和乳酸鏈球菌素的相互影響較顯著。當(dāng)保鮮液含乳酸為 0.5%(pH5.5),抑菌率曲線變化不大且抑菌效果較差;隨著乳酸量的增加,pH隨之下降,乳酸鏈球菌素的抑菌作用也明顯增加。當(dāng)乳酸添加1.3%(pH2.5)時(shí),抑菌效果最好,這與文獻(xiàn)報(bào)道的乳酸鏈球菌素效價(jià)和最適 pH值之間的關(guān)系一致[4]。但乳酸含量過高,會(huì)導(dǎo)致抑菌率的下降,這是因?yàn)槿樗崾怯袡C(jī)酸,過高含量的乳酸 pH變化已經(jīng)不明顯,由于試驗(yàn)采用的食品工業(yè)用乳酸,其中含有 Ca2+,在高價(jià)離子存在的情況下,可能降低乳酸鏈球菌素的抑菌效果[5]。

2.3 年糕復(fù)合抑菌劑

通過對(duì)模型方程求導(dǎo),得到曲面的極值點(diǎn)即響應(yīng)值抑菌率的最大值為 0.70,對(duì)應(yīng)的殼聚糖為2.22%,乳酸為 1.34%,乳酸鏈球菌素為 0.30 g/L。結(jié)合實(shí)際,考慮到乳酸鏈球菌素成本、殼聚糖成膜處理對(duì)生產(chǎn)工藝變化和乳酸對(duì)年糕風(fēng)味的影響,將復(fù)合抑菌劑修正為殼聚糖2%,乳酸1%,乳酸鏈球菌素0.30 g/L,預(yù)測抑菌率為 0.65。通過驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果所得的平均抑菌率 (重復(fù) 3次)為 0.60,和理論預(yù)測值 0.65比較誤差在 7%。

綜合分析單因素試驗(yàn)及復(fù)合抑菌劑試驗(yàn),采用殼聚糖 2%,乳酸 1%,乳酸鏈球菌素 0.30 g/L,丙酸鈣 0.3 g/L的復(fù)合抑菌劑,用涂膜法處理年糕片,待干后真空包裝,于 25℃環(huán)境下放置 120 d無變質(zhì),菌落總數(shù)測定 <1 000 cfu/g,低于年糕行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),而對(duì)照(25℃環(huán)境下放置 10 d)有明顯霉斑,該抑菌劑大大延長了年糕的保質(zhì)期。

3 結(jié)論

3.1 單因素試驗(yàn)表明:乳酸鏈球菌素對(duì)年糕中細(xì)菌有較好的抑制效果,抑制效果呈正相關(guān)系;丙酸鈣對(duì)年糕中霉菌有較好的抑制作用,當(dāng)丙酸鈣質(zhì)量濃度>0.3 g/L時(shí),無霉斑產(chǎn)生;乳酸對(duì)年糕腐敗菌的抑制作用是通過降低 pH對(duì)微生物生長的影響,pH越低抑制越明顯。

3.2 試驗(yàn)通過中心組合設(shè)計(jì) (CCD)并建立回歸模型,經(jīng)驗(yàn)證回歸的擬合程度好 (R2=0.967 9)。從模型中看出,乳酸鏈球菌素和乳酸對(duì)年糕保鮮的抑菌作用極為顯著,二者的交互影響作用也極為顯著,殼聚糖濃度影響抑菌劑成膜的厚薄,從而影響到抑菌效果。

3.3 綜合考慮各種因素,得出年糕復(fù)合抑菌劑配方為殼聚糖 2%、乳酸 1%、乳酸鏈球菌素 0.30 g/L、丙酸鈣 0.3 g/L。采用該抑菌保鮮液進(jìn)行涂膜處理年糕,真空包裝后于 25℃下放置 120 d無變質(zhì),菌落總數(shù)測定 <1 000 g/cfu,該技術(shù)在生產(chǎn)上有積極的應(yīng)用價(jià)值。

[1]胡慶松,劉青梅,楊性民,等,年糕腐敗菌的鑒定和菌系分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009,28(4)45-49

[2]鞠國泉,陳煥明.殼聚糖 -有機(jī)酸復(fù)合物常溫下對(duì)草莓保鮮的作用研究[J].食品研究與開發(fā),2006(3):178-180

[3]李紅,趙春燕.乳酸鏈球菌素的研究進(jìn)展[J].食品科技, 2006,1:75-78

[4]賀家亮,秦翠麗,康懷彬,等.乳酸鏈球菌素的研究現(xiàn)狀[J].中國食品添加劑,2004,3:40-43

[5]黃琴,馬國霞,周緒霞,等.乳鏈菌肽的抑菌機(jī)制[J].中國食品學(xué)報(bào),2007,7(2):128-132

[6]衛(wèi)一其.丙酸鈣對(duì)面包防霉效果觀察 [J].中國公共衛(wèi)生管理,2002(6):491-492

[7]汪多仁.L-乳酸的開發(fā)與應(yīng)用進(jìn)展 [J].糧食加工,2009 (1):44-47

[8]慕運(yùn)動(dòng).響應(yīng)面方法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用 [J].鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào),2001,22(3):91-94

[9]孫力軍,陸兆新,陳磊,等.金銀花內(nèi)生菌 EJH-1抗菌作用發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面法優(yōu)化 [J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006,29(3):108-113.

For mulating a Compound Inhibitor against SpoilageMicroorganis ms in Rice Cake

Liu Qingmei1Hu Qingsong1,2Yang Xingming1Yu Zhifang2

(ZhejiangWanliUniversity,Ningbo Key Lab ofAgriculture Product Processing Technology1,Ningbo 315100)
(College of Food Science and Technology,Nanjing AgriculturalUniversity2,Nanjing 210095)

The effects of nisin,calcium propionate,lactic acid and chitosan on the growth of spoilage microor2 ganis ms in rice cake were investigated by the response surface method.A regression modelwas established with cen2 tral composite design.Results:Nisin and lactic acid inhibit the growth of spoilage microorganisms significantly,and there is remarkable interaction effect between nisin and lactic acid.Calcium propionate can decrease the mold growth in rice cake.The inhibition effect of chitosan for spoilage microorganisms is concentration dependent.The formulated optimal compound inhibitor is chitosan 2%,lactic acid 1%,nisin 0.30 g/L,and calcium propionate 0.3 g/L.U2 sing the compound inhibitor,the shelf life of the rice cake with vacuum package extends to 120 d at 25℃,with mi2 croorganis m number<1 000 cfu/g.

rice cake,response surface methodology,bacteriostatic

TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1003-0174(2010)09-0097-05

科技部“十一五”國家科技支撐計(jì)劃(2008BADA0B04)

2009-10-02

劉青梅,女,1960年出生,教授,碩士生導(dǎo)師,農(nóng)產(chǎn)品貯藏及加工