邵元龍 董 英

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,鎮(zhèn)江 212013)

醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕中抗氧化物質(zhì)提取條件的優(yōu)化

邵元龍 董 英

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,鎮(zhèn)江 212013)

采用正交設(shè)計(jì)和響應(yīng)面的試驗(yàn)方法,對醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕中的抗氧化物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,正交優(yōu)化試驗(yàn)中,影響提取發(fā)酵芝麻餅粕中抗氧化物質(zhì)因素的主次順序?yàn)?乙醇體積分?jǐn)?shù) >液料比 >提取時(shí)間 >提取次數(shù)。通過響應(yīng)面試驗(yàn)再優(yōu)化,得到影響提取抗氧化物質(zhì)因素的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型方程為:RSA=82.22+0.32A+1.88B+0.91C-0.21AB-0.78AC+0.45BC-4.71A2-4.066B2-3.16C2。優(yōu)化的提取條件為:提取時(shí)間 120.4 min,液料比 15.7 mL/g,乙醇體積分?jǐn)?shù) 61.3%,在此條件下,DPPH自由基清除率可達(dá) 81.5%。該結(jié)果為下一步對提取的抗氧化物質(zhì)的分離和發(fā)酵機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

芝麻餅粕 醬油曲霉 優(yōu)化 提取 抗氧化物質(zhì)

在亞洲國家,芝麻廣泛應(yīng)用在各種傳統(tǒng)食品中,并且是世界上重要的油料作物之一,我國 2007年的產(chǎn)量已達(dá)到59萬噸。上世紀(jì) 90年代,逐漸重視芝麻中木脂素類物質(zhì)的研究,這類物質(zhì)是重要的抗氧化劑,具有多種生理功能[1-3]。木脂素約占芝麻的0.5%～1.0%,分為脂溶性和水溶性兩類,如芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚等[4-9]。在提油過程中,部分木脂素轉(zhuǎn)移到芝麻餅粕中,其提取方法和生理活性一直是研究的熱點(diǎn)[10]。

單純的分離和鑒定木脂素已不能滿足未來對抗氧化劑的需求,應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)方法尋找新抗氧化劑來源前景廣闊。董英等[11]用醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕,發(fā)現(xiàn)可以提高其抗氧化活性,對其提取條件并未深入探討。因此,本試驗(yàn)仍選用該菌株對芝麻餅粕進(jìn)行發(fā)酵,以抗氧化活性為指標(biāo),對提取條件再優(yōu)化,為下一步對發(fā)酵芝麻餅粕中抗氧化物質(zhì)的分離純化和轉(zhuǎn)化機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

醬油曲霉 (Aspergillus sojae),CI CC 2128:中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;芝麻餅粕:江蘇鎮(zhèn)江京友調(diào)味品公司[12];二苯代苦味肼基自由基 (2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH):美國 Sigma公司。

HH-S恒溫水浴鍋:江蘇金壇醫(yī)療儀器廠; Y M50A電熱蒸汽壓力滅菌器:上海三申醫(yī)療器械有限公司;PSX智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱:寧波來福科技有限公司;WFJ-7200可見分光光度計(jì):尤尼柯 (上海)儀器有限公司。

1.2 接種與發(fā)酵方法

醬油曲霉接種于土豆汁 (PDA)斜面培養(yǎng)基上, 28℃培養(yǎng) 72 h后,加入 10 mL無菌生理鹽水,用接種針刮下,調(diào)節(jié)菌液濃度為 0.86×108cfu/mL。取烘干粉碎的芝麻餅粕,按料液比為 1:3的比例加入正己烷,45℃水浴攪拌 3 h,4 000 r/min離心 10 min,沉淀自然晾干,得脫脂芝麻餅粕。取 10 g烘干的脫脂芝麻餅粕加入9 mL蒸餾水,于121℃滅菌20 min,冷卻后,接種 1 mL制備好的種子懸液,搖勻,于 28℃條件下發(fā)酵 144 h,72 h時(shí)搖勻一次,直至發(fā)酵結(jié)束。

1.3 提取工藝優(yōu)化方法

1.3.1 正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在多次單因子對比試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時(shí)間 (B)、總乙醇體積與芝麻餅粕質(zhì)量比(液料比)(C)和提取次數(shù) (D)4個因素,考察 4因素對自由基清除率的影響,試驗(yàn)因素水平見表 1。發(fā)酵結(jié)束后,按試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案加入提取液,于 50℃水浴攪拌提取,轉(zhuǎn)速 150 r/min。提取液于 5 000 r/min離心 10 min。上清液經(jīng)濃縮或添加提取液,統(tǒng)一定容至 150 mL。對提取液的自由基清除率進(jìn)行測定和分析。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在探討了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液料比和提取次數(shù)對提取物抗氧化活性影響的基礎(chǔ)上,優(yōu)化出 3個主要的影響因素。根據(jù) Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以提取時(shí)間、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量,自由基清除率為響應(yīng)值,對這 3個因素進(jìn)一步優(yōu)化,設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),試驗(yàn)的因素和水平取值見表 2。發(fā)酵條件和提取液處理?xiàng)l件與正交試驗(yàn)一致。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.3 DPPH自由基清除率測定 (Radical Scavenging Activity,RSA)

取定容的發(fā)酵提取液 1 mL,用 50%的乙醇稀釋10倍,作為樣品液。DPPH溶液濃度為 7.5×10-6mol/mL,波長 517 nm,50%乙醇為對照。每個樣品重復(fù)測定 2次,求平均值。

計(jì)算公式為:

式中:A0為 5 mL DPPH與 1 mL乙醇混合液的吸光度;Ai為 5 mL DPPH與 1 mL樣品反應(yīng)后的吸光度;Aj為 5 mL乙醇與 1 mL樣品混合液的吸光度[13]。

2 結(jié)果和討論

2.1 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

從表 3可知,影響抗氧化物提取率因素的主次為A>C>B>D,即乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率影響最大,其次為液料比和提取時(shí)間,最弱的為提取次數(shù)。乙醇體積分?jǐn)?shù)為 60%時(shí),提取物的平均自由基清除率為71.46%,大于 80%時(shí)的平均清除率為 69.02%,但無顯著的差異,提取次數(shù)之間差異微弱。從提取過程可操作性及經(jīng)濟(jì)學(xué)考慮,提取溶液體積和濃度,都應(yīng)盡可能減小,且采用單次提取。

表 3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)及結(jié)果

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表 4,對所得數(shù)據(jù)采用Desigh-Expert 7.0 Trial軟件中的 RS(response sur2 face)程序進(jìn)行分析,應(yīng)用Model Graph程序作響應(yīng)曲面圖和等高線圖。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

經(jīng)回歸擬合,獲得Aspergillus發(fā)酵芝麻餅粕提取物抗氧化活性對自變量提取時(shí)間、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的二次多項(xiàng)回歸方程為:

RSA=82.22+0.32A+1.88B+0.91C-0.21AB-0.78AC+0.45BC-4.71A2-4.066B2-3.16C2

模型方差分析見表 5,試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性(P<0.000 1),失擬項(xiàng)不顯著(P =0.075 3)。所以自由基清除率與預(yù)測值之間具有較好的擬合優(yōu)度,可用于Aspergillus固體發(fā)酵提取物抗氧化活性的分析和預(yù)測。從 3個因素對提取物抗氧化活性的影響來看,回歸方程的一次項(xiàng)中B和 C對發(fā)酵提取物抗氧化活性的影響極顯著(P<0.01),且影響能力B>C,即液料比 >乙醇體積分?jǐn)?shù),提取時(shí)間的線性影響不顯著,各因素二次項(xiàng)A2、B2和 C2的影響也達(dá)到了極顯著水平,交互作用項(xiàng)中僅 AC達(dá)到了顯著(P<0.05)的水平。這也表明了響應(yīng)值的變化復(fù)雜,不僅受單因素的影響,而且還存在交互作用。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表

對回歸方程進(jìn)行數(shù)學(xué)分析,可得到最大響應(yīng)值所對應(yīng)的提取條件,擇優(yōu)的提取條件為:提取時(shí)間120.4 min,液料比 15.7 mL/g,乙醇體積分?jǐn)?shù) 61.3%,理論提取物抗氧化活性為 82.5%。為了驗(yàn)證該結(jié)果,按照該條件做 5次驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果分別為 79.24%、81.18%、82.39%、83.47%和 81.33%,平均值為81.5%,與理論值差異不顯著,優(yōu)化的結(jié)果有意義。

2.3 響應(yīng)面的等高線圖和曲面圖

通過二次回歸方程所作的響應(yīng)曲面圖及等高線圖如圖 1和圖2。

圖 1 時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用的等高線圖及其曲面圖

圖 2 液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用的等高線圖及其曲面圖

圖 1顯示了提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取物抗氧化能力的影響效應(yīng)。由圖可知,兩因素之間存在較強(qiáng)的交互作用,在試驗(yàn)條件范圍內(nèi),隨著提取時(shí)間的延長,乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高,提取物抗氧化活性迅速提高,達(dá)到一定值后,又明顯下降。由圖 2可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比均趨向于較大取值點(diǎn)時(shí)抗氧化活性較高。而時(shí)間和料液比的相互作用對提取物抗氧化能力的影響不顯著。

3 結(jié)論

3.1 通過正交優(yōu)化試驗(yàn)得出,影響從醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕中提取抗氧化物質(zhì)的各因素的主次順序?yàn)?A>C>B>D,即乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率影響最大,其次為液料比和提取時(shí)間,最弱的為提取次數(shù)。3.2 利用 Design expert設(shè)計(jì)軟件,采用響應(yīng)面分析法建立了從醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕中提取抗氧化物質(zhì)的提取工藝條件的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型,并對各因素對響應(yīng)值的影響進(jìn)行了分析。擬合的考察因素與抗氧化活性之間的二次回歸方程為:RSA=82.22+ 0.32A+1.88B+0.91C-0.21AB-0.78AC+0.45BC-4.71A2-4.066B2-3.16C2,用該方程獲得預(yù)測值與實(shí)際值擬合度高。優(yōu)化的提取條件條件為:提取時(shí)間 120.4 min,液料比 15.7 mL/g,乙醇體積分?jǐn)?shù)61.3%,在此條件下,發(fā)酵提取物的抗氧化活性可達(dá)81.5%。

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Optimizing Extraction Conditions ofAntioxidantion Material inAspergillus sojaeFer mented SesameMeal

Shao Yuanlong Dong Ying
(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013)

Orthogonal design and response surface methodologywere applied to optimize the extraction technolo2 gy of antioxidantmaterial from sesame meal fer mentated byAspergillus sojae.Results:The effects of the infuencing factors for the antioxdation material extraction rank as ethanol volume fraction>ratio of solution to material>time> extraction times in orthogonal design.The regression quadratic equation of RS M to re-optimization experiment fac2 tors influencing the extraction of antioxidantion materials is:RSA=82.22+0.32A+1.88B+0.91C-0.21AB-0.78AC+0.45BC-4.71A2-4.066B2-3.16C2,The optimum extraction conditions are time 6h,ratio of solution to material 15.7 mL/g and ethanol volume fraction 61.3%.TheDPPH radical scavening capacity is 81.5%in the pres2 ent experiment.

sesame meal,Aspergillus sojae,optimization,extraction,antioxidantmaterial

TS201 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1003-0174(2010)06-0062-04

江蘇省科技攻關(guān)項(xiàng)目(BE2005335)

2009-01-09

邵元龍,男,1977年出生,博士,生物資源的深度開發(fā)與利用

董英,女,1954年出生,教授,博士生導(dǎo)師,生物化學(xué)