汪 勇宋坷珂王麗麗韓 雪趙謀明

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院1,廣州 510641)

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系2,廣州 510632)

反相高效液相色譜法測(cè)定甘油二酯含量研究

汪 勇1,2宋坷珂2王麗麗2韓 雪2趙謀明1

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院1,廣州 510641)

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系2,廣州 510632)

用分子蒸餾和柱層析的方法制備了大豆油甘油二酯 (DAG)的標(biāo)準(zhǔn)樣品,通過高效液相 -電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-ESI-MS)和薄層色譜法 (TLC)驗(yàn)證了標(biāo)準(zhǔn)樣品的純度。用反相高效液相色譜 (RPHPLC)在UV=210 nm做大豆油DAG的標(biāo)準(zhǔn)曲線,在質(zhì)量濃度范圍 1.0～12.0 mg/mL,大豆油DAG標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。通過加樣回收試驗(yàn)表明,加樣回收率在 104%～109%之間,RSD在 0.69%～5.19%之間。并用該方法分析了大豆油、分子蒸餾DAG樣品中的DAG。

甘油二酯 反相高效液相色譜 分子蒸餾

甘油二酯 (diacylglycerol,DAG)是一種新興的保健油脂。由于甘油二酯和食用油中的主要成分三酰甘油有截然不同的代謝途徑,食用甘油二酯可以降低餐后血脂水平從而防止和控制肥胖[1]。1999年,花王公司首先在日本市場(chǎng)推廣DAG油,DAG烹調(diào)油在日本市場(chǎng)稱為“Econa健康烹調(diào)油”,在美國(guó)稱為“Enova oil”,由花王公司和美國(guó) ADM公司合資生產(chǎn)[2]。

甘油二酯(DAG)的分析可以用薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)[3-5]、高效液相色譜法 (high perfor mance liquied chromatography,HPLC)[6-7]和氣相色譜法 (gas chromatography,GC)等[8-10]。TLC法的缺點(diǎn)是精度不高,GC需要專門的高溫氣相色譜通過程序升溫到接近 380℃,由于采用程序升溫,基線漂移較大。HPLC是一種高效、準(zhǔn)確的分析方法,色譜柱主要有正相柱 (normal phase,NP)和反相柱 (re2 versed phase,RP)兩種。RP-HPLC在油脂分析中使用更加普遍,因?yàn)橛椭臉O性相對(duì)較小,使用反相柱可以獲得比正相柱更好的分離效果。前期采用磷脂酶A1催化水解大豆油制備富含甘油二酯的油脂,主要采用高效液相色譜折光指數(shù) (R I)檢測(cè)器分析樣品中甘油二酯的相對(duì)含量[11-12],這種方法雖然操作方便,但是無法測(cè)定DAG的絕對(duì)含量。

利用二極管陣列 (PDA)檢測(cè)器對(duì)原料和酶水解產(chǎn)品的甘油二酯組成種類和含量進(jìn)行了分析和比較。通過自制甘油二酯(DAG)標(biāo)準(zhǔn)樣品,建立DAG的標(biāo)準(zhǔn)曲線,達(dá)到快速準(zhǔn)確分析和檢測(cè) DAG的目的。同時(shí)通過液相色譜/電噴霧質(zhì)譜 (HPLC/ESI/ MS)聯(lián)用鑒定水解產(chǎn)物和原料中的甘油酯成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆油:張家港東海糧油工業(yè)有限公司;磷脂酶A1(Lecitase Ultra)(酶活力 10 000 U/g):丹麥諾維信公司;SI L GF254硅膠板:青島海洋化工有限公司。

LC20-AT液相色譜系統(tǒng):日本島津儀器有限公司;4000 Q TRAP型液相質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國(guó)應(yīng)用生物技術(shù)有限公司;MD-80型分子蒸餾設(shè)備:廣州漢維有限公司。

1.2 甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)樣品通過分子蒸餾和柱層析制備,方法如下:50.00 g大豆油加酶量 30 U/g,溫度45℃,加水量 40%,經(jīng)過磷脂酶A1催化下水解8 h。反應(yīng)后靜置分層 60 min,上層為水解油層。油層在160℃分子蒸餾脫酸,收集重相。重相在 215℃分子蒸餾,收集輕相甘油二酯油 (Diacylglycerol oil,DO),取 1.00 gDO溶解在 20 mL的正己烷中,然后溶液上硅膠柱 (<1.5 cm×30 cm)。DO中的三酰甘油(TAG)用250 mL的正己烷洗脫除去,DAG用400 mL的乙醚/正己烷 (3∶7,體積比)洗脫收集。DAG標(biāo)準(zhǔn)樣品用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空下脫溶劑,得到 DAG標(biāo)準(zhǔn)樣品。標(biāo)準(zhǔn)樣品的純度通過薄層色譜(TLC)和 HPLC/ ESI/MS鑒定純度。TLC展開劑為苯/乙醚/乙酸乙酯/乙酸 (80∶10∶10∶0.2,體積比)。通過碘蒸氣顯色。

1.3 大豆油甘油二酯的制備

通過磷脂酶A1催化水解,一次分子蒸餾制得富含甘油二酯大豆油,二次分子蒸餾制得大豆油DAG[12]。

1.4 原料及產(chǎn)品的 HPLC/ESI/MS分析

將大豆油、分子蒸餾產(chǎn)品和標(biāo)準(zhǔn)樣品配成 1.0 mg/L的樣品,進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀,測(cè)定各組分的分子離子峰。HPLC條件為:流動(dòng)相(乙腈/異丙醇/甲酸,550∶450∶0.5),流速 0.2 mL/min,柱溫:40℃,色譜柱:Pin2 nacle IIC18 5μm(150×2.1 mm i.d.)(美國(guó) Restek公司),質(zhì)譜條件為:電噴霧 (ESI)離子源,正離子模式,m/z∶300～1 200,離子掃描速率為 5 500 amu/s。

1.5 HPLC分析甘油二酯

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)準(zhǔn)樣品配成 10.0、5.0、3.3、2.5、1.25 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液,用 HPLC在 PDA(UV=210 nm)檢測(cè)器中分析產(chǎn)品組成。色譜條件為:流動(dòng)相 (乙腈/異丙醇,56∶44),流速 1.0 mL/min,柱溫 40℃,色譜柱為Diamonsil C18(5μm 150×4.6mm,天津迪馬科技有限公司)。選取 PP、OO+PO、LO、LL和LLn(P,棕櫚酸;L,亞油酸;Ln,亞麻酸;O,油酸。)5個(gè)甘油二酯峰作為特征峰,以濃度為橫坐標(biāo),以 DAG特征峰面積之和為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

原料和DAG樣品配成 10.0～20.0 mg/mL的樣品溶液,用HPLC在 PDA(UV=210 nm)檢測(cè)器中分析產(chǎn)品組成,選取 PP、OO+PO、LO、LL和LLn 5個(gè)甘油二酯峰作為特征峰計(jì)算峰面積之和,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中甘油二酯的含量。

1.5.2 加樣回收

表1 加樣回收樣品中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的添加量

將大豆油原料配成 22.0 mg/mL的樣品液 (A),取樣品液和標(biāo)準(zhǔn)液 10.86 mg/mL(B),按表 1配成待測(cè)定樣品。測(cè)定各樣品的DAG質(zhì)量濃度,并計(jì)算加樣回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和加樣回收

大豆油DAG標(biāo)準(zhǔn)樣品的 HPLC(UV=210 nm)圖譜見圖 1?？梢钥闯?標(biāo)準(zhǔn)樣品中都是DAG的峰。通過 TLC分離,再經(jīng)過碘蒸汽顯色 (圖 2)可以看見只有DAG的點(diǎn)。另外經(jīng)過 HPLC/ESI/MS檢測(cè)在標(biāo)準(zhǔn)樣品中沒有發(fā)現(xiàn)單甘酯(MAG)和 TAG的分子離子峰,從而證明了標(biāo)準(zhǔn)樣品的純度很高。

圖1 大豆油DAG標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC圖譜

由于大豆油的 DAG是混合物,其中還包括DAG的異構(gòu)體,所以不可能商業(yè)化地購(gòu)買所有的DAG的標(biāo)準(zhǔn)樣品用來確定每一種DAG的含量。而且由于各種植物油的DAG的種類和比例有自身的特點(diǎn),所以最好的 DAG標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)該是從原料本身制備出來的,因?yàn)檫@種制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品和樣品中的DAG的種類一致,可以很好的反映樣品中DAG的組成。由于不同 DAG在紫外的相應(yīng)系數(shù)不同,所以這種從原料中制備的標(biāo)準(zhǔn) DAG樣品,遠(yuǎn)比一兩個(gè)商業(yè)化的 DAG標(biāo)樣更具有代表性,而且測(cè)定更加準(zhǔn)確。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)DAG樣品和大豆油的 TLC圖譜

通過 HPLC/ESI/MS按照出峰時(shí)間以及分子離子峰的質(zhì)荷比數(shù)值可以準(zhǔn)確有效的分析原料及水解產(chǎn)品中各種甘油酯的成分。電噴霧離子化 (ESI)是一種溫和的離子化技術(shù),這種技術(shù)只產(chǎn)生物質(zhì)的分子離子峰,而不會(huì)像電子轟擊質(zhì)譜那樣的得到過多的碎片峰,非常適合物質(zhì)分子量的測(cè)定[13]。但是ESI技術(shù)一般會(huì)產(chǎn)生分子和 Na+和 K+的復(fù)合離子峰,原因是在樣品中或者樣品池中含有微量的 Na+和 K+,這個(gè)復(fù)合離子在質(zhì)譜中的響應(yīng)值遠(yuǎn)比分子的[M+H]+高,一些研究也提到了在 ESI質(zhì)譜圖中出現(xiàn)脂質(zhì)的 Na+和 K+的復(fù)合離子峰[14-16]。大豆油和大豆油DAG產(chǎn)品部分典型TAG和DAG的質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 大豆油和大豆油DAG中的典型 TAG和DAG的鈉和鉀結(jié)合分子離子[M+Na]+和[M+K]+

大豆油DAG標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4,在質(zhì)量濃度 1.0～12.0 mg/mL范圍具有很好的線性關(guān)系。

圖4 大豆油DAG的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線

加樣回收數(shù)據(jù)見表 2,可以看出,DAG標(biāo)準(zhǔn)樣品加樣回收率在 104%～109%之間,RSD在0.69%～5.19%之間,證明采用制備的DAG標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定樣品中的DAG含量方法準(zhǔn)確可靠。

表2 大豆油DAG標(biāo)準(zhǔn)樣品加樣回收

2.2 大豆油DAG樣品中DAG含量的測(cè)定

通過 RP-HPLC法測(cè)定大豆油、酶催化水解液、富含DAG大豆油和大豆油DAG的DAG含量見表3,色譜圖見圖 5,通過分子蒸餾可以很好的去除磷脂酶A1水解大豆油釋放出的脂肪酸以及純化甘油二酯。用RP-HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以很好的測(cè)定磷脂酶A1催化水解大豆油,以及分子蒸餾制備甘油二酯產(chǎn)品的DAG含量。

表3 HPLC法測(cè)定的不同原料的DAG含量

圖5 大豆油DAG油脂的RP-HPLC圖譜

3 結(jié)論

采用分子蒸餾和柱層析的方法制備了大豆油DAG的標(biāo)準(zhǔn)樣品,通過 HPLC/ESI/MS和 TLC分析該標(biāo)準(zhǔn)樣品中無MAG和 TAG組分,DAG純度高。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和加樣回收試驗(yàn)證明,在質(zhì)量濃度范圍 1.0～12.0 mg/mL,大豆油DAG標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好,加樣回收率在104%～109%之間,RSD在0.69%～5.19%之間。采用DAG標(biāo)準(zhǔn)樣品分析原料和產(chǎn)物中DAG的含量的方法準(zhǔn)確可靠。

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Deter mination ofDiacylglycerol Content by Reversed Phase High Perfor mance Liquid Chromatography

Wang Yong1,2Song Keke2Wang Lili2Han Xue2Zhao Mouming1

(College ofLight industry and Food Science,South China University of Technology1,Guangzhou 510641)
(Department of Food Science and Engineering,Jinan University2,Guangzhou 510632)

Soybean diacylglycerols(DAG)reference materialwas prepared by combination of molecular distil2 lation and column chromatography.The purity of the reference materialwas verified by high performance liquid chro2 matography/electrospray ionization/mass spectrometry and thin layer chromatography.Results:The calibration curve of soybean DAG built by reversed phase-HPLC at UV=210 nm shows a good linear at concentrations in range of 1.0～12.0 mg/mL.Recovery experiments show the recoveries of samples are in range of 104%～109%with RSD in range of 0.69%～5.19%.The contents ofDAG in soybean oil and its related DAG samples produced by molecular distillation were analyzed by thismethod.

diacylglycerol,reversed phase-HPLC,molecular distillation

TS227 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1003-0174(2010)03-0119-05

廣東省科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目(2008A01090003)

2009-04-11

汪勇,男,1977年出生,講師,博士,糧食、油脂及植物蛋白工程

趙謀明,男,1964年出生,男,教授,博士生導(dǎo)師,食品科學(xué)