王婷婷李愛科易建明陶浩瀚汪 洋

(國(guó)家糧食局科學(xué)研究院1,北京 100037)

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2,武漢 430070)

飼用屎腸球菌的篩選、鑒定及其生物學(xué)特性

王婷婷1李愛科1易建明2陶浩瀚1汪 洋1

(國(guó)家糧食局科學(xué)研究院1,北京 100037)

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2,武漢 430070)

分別采用腸球菌選擇性培養(yǎng)基(EC)從健康嬰兒的糞便、健康仔豬的腸道及糞便中分離篩選了 4株屎腸球菌,分別命名為 EfB、Ef1-2、Ef3-4、Ef4-1,利用 Biolog自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果表明,它們都是屎腸球菌,而且經(jīng)16S rRNA基因序列測(cè)序比較分析,表明這4株菌與數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的屎腸球菌16S rRNA序列(AccessionNo.AY675247)同源性均為 99%,兩者鑒定結(jié)果一致。試驗(yàn)表明,所篩得菌株生長(zhǎng)速度較快,且對(duì)致病型大腸桿菌 K88,K99,金黃色葡萄球菌,巴氏桿菌及沙門氏菌都有較強(qiáng)的抑制作用,其中對(duì)大腸桿菌K99的抑菌效果最好。屎腸球菌新菌種的鑒定與篩選為開發(fā)新型微生態(tài)類飼料添加劑提供了幫助。

屎腸球菌 Biolog自動(dòng)微生物分析系統(tǒng) 16S rRNA鑒定 生長(zhǎng)代謝曲線 抑菌能力

飼用抗生素雖在動(dòng)物保健和畜牧生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用,但是長(zhǎng)期使用及濫用飼用抗生素的弊端正日益受到重視。微生態(tài)制劑是通過改善寄主腸道菌群平衡而發(fā)揮有益作用的活的益生菌制劑,以其綠色安全、無毒副作用、無殘留的優(yōu)點(diǎn)逐步成為替代抗生素類添加劑的主力軍。屎腸球菌屬于乳酸菌,由于它生長(zhǎng)速度快,有較好的黏附能力,能產(chǎn)生乳酸及一些抗菌物質(zhì)[1]被廣泛的用作為益生菌制劑。屎腸球菌在環(huán)境中廣泛存在,并且屬于腸道共生菌[2],在很多動(dòng)物新出生的 2～3 d內(nèi)占優(yōu)勢(shì)地位[3],并且是一種兼性厭氧的乳酸菌,與厭氧、培養(yǎng)保存條件苛刻的雙歧桿菌相比,更適合于生產(chǎn)和應(yīng)用。1989年美國(guó) FDA就公布它為可直接用于動(dòng)物的菌種之一。

近 20年來,一系列商品化自動(dòng)鑒定系統(tǒng)相繼推出并在應(yīng)用中取得理想效果,如 V ITEK系統(tǒng)、M ID I系統(tǒng)、Biolog系統(tǒng)、SENSITITRE系統(tǒng)、AUTOSCEPTOR系統(tǒng)以及M ICROSCAN系統(tǒng)等[4],其中細(xì)胞脂肪酸分析的M ID I系統(tǒng)、碳源利用分析的 Biolog系統(tǒng)與DNA序列分析的 16S rRNA基因進(jìn)化發(fā)育系統(tǒng)已經(jīng)成為目前國(guó)際上細(xì)菌多相分類鑒定常用的技術(shù)手段[5-7]。

從初生健康嬰兒糞便、8日齡健康仔豬糞便、5日齡健康仔豬回腸黏膜、空腸黏膜中篩選 4株產(chǎn)酸能力強(qiáng),抑菌效果明顯的屎腸球菌,并采用 Biolog和16S rRNA兩種鑒定方法對(duì)其進(jìn)行了鑒定,并對(duì)其生長(zhǎng)特性及抑菌特性進(jìn)行了研究,以期得到可廣泛應(yīng)用于飼料行業(yè)的屎腸球菌新菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)菌種

大腸桿菌 K88,大腸桿菌 K99,沙門氏菌,金黃色葡萄球菌及巴氏桿菌:中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)測(cè)所。

1.1.2 培養(yǎng)基

屎腸球菌選擇性培養(yǎng)基 (EC):胰蛋白胨 2 g,酵母浸膏 0.5 g,葡萄糖 0.2 g,Na2HPO40.4 g,K2HPO40.4 g,瓊脂 2 g,雙蒸水 100 mL,pH 7.4,冷至 45～50℃。加入 NaN3至終質(zhì)量濃度為 0.000 4 g/mL 2,3,5-氯化三苯四氮唑 (TTC)0.000 1 g/mL,倒平板。MRS、LB和肉湯培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制。

MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨 10 g,牛肉浸膏 10 g,酵母浸膏 5 g,K2HPO42 g,檸檬酸氫二銨 2 g,葡萄糖20 g,乙酸鈉 5 g,Tween-80 1mL,MgSO4·7H2O 0.58 g,MnSO4·4H2O 0.25 g,1000 mL蒸餾水,用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至 pH7.0,115℃滅菌 30 min。MRS固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入 1.5%的瓊脂。

1.1.3 主要試驗(yàn)儀器

BCN-1360B超凈工作臺(tái):哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;SBA-40C生物傳感儀:山東省科學(xué)院生物研究所;梯度 PCR儀;BXT-26-M凝膠電泳成像儀:德國(guó)艾本德股份公司;DYY-8C電泳儀:北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 屎腸球菌的分離

無菌采集初生健康嬰兒糞便 1 g,8日齡健康仔豬糞便 1 g,5日齡健康仔豬回腸黏膜,空腸黏膜用滅菌的載玻片刮取回腸、小腸黏液,用滅菌生理鹽水稀釋 104倍,取 0.1mL接種于 EC培養(yǎng)基平板上,37℃厭氧培養(yǎng) 24 h,挑取紫紅色,表面光滑凸起,周邊整齊,直徑1.0～1.5 mm的菌落,傳代于 EC基礎(chǔ)斜面,涂片,革蘭氏染色鏡檢,篩選 G+,圓形或卵圓形,單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀排列的菌株。然后將篩選菌株再在MRS平板上劃線接種純培養(yǎng)。

MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng) 16 h,取樣測(cè)乳酸產(chǎn)量,采用牛津杯法[8]對(duì)大腸桿菌 K88做抑菌試驗(yàn),培養(yǎng)液在 80℃水浴 10 min,取原液 0.4 mL涂板挑取 80℃水浴存活的菌種接到斜面上,選取 80℃水浴存活的菌種,乳酸產(chǎn)量較高,抑菌作用明顯的菌株甘油保種。

1.2.2 pH值測(cè)定

將上述的純培養(yǎng)物取 1 mL接種于 100 mL裝有MRS液體培養(yǎng)基的 300 mL的三角瓶中,37℃培養(yǎng)16 h,分別檢測(cè)各培養(yǎng)液的 pH值。

1.2.3 屎腸球菌的生理生化指標(biāo)鑒定

按伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[9]中屎腸球菌的生理生化特性,對(duì)上述分離的 4株腸球菌進(jìn)行溫度 (10℃、45℃)、耐酸、耐 NaCl、運(yùn)動(dòng)性及糖類發(fā)酵等生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.4 屎腸球菌的Biolog鑒定

按照Biolog GP2微生物鑒定微孔板使用手冊(cè)和Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng) -細(xì)菌鑒定操作規(guī)程的研究[10]所述的操作步驟對(duì)所篩的菌種進(jìn)行 Biolog鑒定。

1.2.5 屎腸球菌 16S rRNA鑒定

1.2.5.1屎腸球菌總DNA的提取

煮沸法提取腸球菌總 DNA:取 1 mL菌液, 12 000 r/min離心 2 min,棄去上清液,加入 1 mL ddH2O,12 000 r/min離心 2 min,棄去上清液,加300μL ddH2O,沸水浴 10 min,放入 -20℃冰浴10 min,12 000 r/min離心 2 min,取上清液于滅過菌的1.5 mL的離心管中。

1.2.5.2 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增及其檢測(cè)

正向引物:5′-GAG TTT GAT CCT GGC TCA GGA CGA-3′,反向引物:5′-CGC ACC TTC CGA TAC GGG CTA CCT-3′[11]由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

上游引物(24 bp)1μL,下游引物 (24 bp)1μL, 10×Buffer 5μL,Mg2+4μL,dNTP2μL,Ex Taq酶1μL,模板 3μL,ddH2O35μL。反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃,5 min;94℃變性 30 s,58℃退火 30 s,72℃延伸 50 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸 5 min。

取 10μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入 2μL溴酚藍(lán)染色液,混勻加在 1%瓊脂糖凝膠(含 goldview2.5μL),1×TAE緩沖液中恒壓 80 V電泳 40 min,用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.2.5.3 PCR擴(kuò)增片段的克隆

采用膠回收試劑盒純化 PCR產(chǎn)物;將純化產(chǎn)物與載體 pMD18-T simper在 16℃連接過夜,將上述產(chǎn)物 10μL與200μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞混合,按常規(guī) CaCl2方法轉(zhuǎn)化并涂布于含氨芐青霉素、X-gal、IPTG的 LB平板上,37℃培養(yǎng) 16～18 h,挑取白色菌落做進(jìn)一步篩選、鑒定。

1.2.5.4 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

將上述白色菌落接種于含氨芐青霉素的 LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng) 18 h,用質(zhì)粒抽提 Kit提純重組質(zhì)粒DNA,取上述提取的質(zhì)粒DNA分別進(jìn)行 PCR及 HandШ?jiǎn)蚊盖序?yàn)證,1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.5.5 基因序列測(cè)定及分析

將鑒定正確的質(zhì)粒寄送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 屎腸球菌生長(zhǎng)代謝曲線的測(cè)定

將低溫保存的屎腸球菌按 1%接入到MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng) 8 h作為種子。將 1 mL種子分別加入100 mL的MRS培養(yǎng)基中,在 37℃,150 r/min培養(yǎng)20 h,每 2 h取樣一次。對(duì)所取樣品分別測(cè)定 OD600,每個(gè)處理做三個(gè)重復(fù),記錄數(shù)據(jù)繪制生長(zhǎng)曲線。使用生物傳感儀分別測(cè)定各點(diǎn)菌體培養(yǎng)液中葡萄糖消耗量及乳酸產(chǎn)量,記錄數(shù)據(jù)繪制代謝曲線。

1.2.7 屎腸球菌抑菌能力的測(cè)定

采用牛津杯法[8]測(cè)定游離培養(yǎng)與微囊化培養(yǎng)屎腸球菌對(duì)大腸桿菌 K88、大腸桿菌 K99、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及巴氏桿菌的抑制能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 屎腸球菌篩選菌株的形態(tài)特性

在 EC選擇性培養(yǎng)基上挑取紫紅色,表面光滑凸起,周邊整齊,直徑 1.0～1.5 mm的菌落,并篩選G+,圓形或卵圓形,短鏈狀排列的菌株 20株。在MRS培養(yǎng)基上純培養(yǎng)后,通過 pH值測(cè)定、乳酸測(cè)定篩選出 12株產(chǎn)酸能力強(qiáng)的腸球菌 (12 h培養(yǎng)后 pH值達(dá) 4.5左右)。通過抑菌試驗(yàn)篩選出不同來源的抑菌能力較強(qiáng)的 4株菌,分別編號(hào)為B,1-2,3-4,4 -1,圖 1為菌株 3-4的形態(tài)圖片。

圖1 菌株3-4的形態(tài)圖片

2.2 屎腸球菌的鑒定

2.2.1 生理生化指標(biāo)鑒定結(jié)果

篩選的 4株菌株生理系列化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果為:革蘭氏陽(yáng)性菌,能在 10℃和 45℃生長(zhǎng),發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸,可生長(zhǎng)于 6.5%NaCl和 40%膽汁鹽環(huán)境中,精氨酸產(chǎn)氨,不分解鼠李糖、松三糖和山梨醇,能分解蔗糖、密二糖、乳糖、麥芽糖和棉子糖,對(duì)慶大霉素、卡那霉素、多黏菌素和鏈霉素不敏感,對(duì)青霉素、紅霉素、萬古霉素和阿莫西林敏感。具體生理生化鑒定結(jié)果見表 1。參照伯杰氏細(xì)菌手冊(cè) (第八版)[9],這 4株腸球菌基本符合屎腸球菌的生理生化特性,分別命名為 EfB、Ef1-2、Ef3-4和 Ef4-1。

表 1 EfB、Ef1-2、Ef3-4和 Ef4-1的生理生化特性

2.2.2 Biolog系統(tǒng)鑒定結(jié)果

Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)主要根據(jù)細(xì)菌對(duì)糖、醇、酸、酯、胺和大分子聚合物等 95種碳源的利用情況進(jìn)行鑒定,其中 A1孔是對(duì)照孔。Biolog系統(tǒng)鑒定結(jié)果主要有 3個(gè)參數(shù),即可能性(Probability,PROB)、相似性 (Si milarity,SI M)和位距 (Distance,D IST),其中 SI M值和D IST值是兩個(gè)重要參數(shù),D IST值表示測(cè)試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)相應(yīng)數(shù)據(jù)條的位置,SI M值表示測(cè)試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)相應(yīng)數(shù)據(jù)條的相似程度[10]。Bi2 olog系統(tǒng)規(guī)定:細(xì)菌培養(yǎng) 4～6 h,其 SI M≥0.75,培養(yǎng)16～24 h時(shí),SI M≥0.5時(shí),系統(tǒng)自動(dòng)給出鑒定結(jié)果為種名,SI M值越接近 1.00,鑒定結(jié)果的可靠性越高;當(dāng)SI M值小于 0.5,但鑒定結(jié)果中屬名相同的結(jié)果的 SI M值之和大于 0.5時(shí),自動(dòng)給出的鑒定結(jié)果為屬名。鑒定結(jié)果見表 2,4株菌均為屎腸球菌。

表 2 4株菌的Biolog系統(tǒng)鑒定結(jié)果

2.2.3 16S rRNA鑒定結(jié)果

PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、溴酚藍(lán)染色后在凝膠成像儀下觀察,結(jié)果見圖 2。

圖2 16S rRNA基因 PCR反應(yīng)產(chǎn)物凝膠電泳圖譜

由圖 2可見,4株菌在 1 000～2 000 bp間都有一個(gè)明顯的條帶,而 16S rRNA基因含有高度保守的基因片段,大約 1.5 kb左右,這表明 PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了預(yù)期長(zhǎng)度的基因序列。

以上擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物克隆連接和轉(zhuǎn)化后,選出含有該擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子,重組體再經(jīng)酶切、PCR鑒定后 (圖 3),均出現(xiàn)了預(yù)期大小的片段。PCR鑒定結(jié)果表明,4株菌都在 1 500 bp左右出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增條帶,HandШ?jiǎn)蚊盖序?yàn)證結(jié)果表明, 4株菌都在 4 200 bp左右出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增條帶,這表明質(zhì)粒重組比較成功。

圖3 重組質(zhì)粒DNA、PCR驗(yàn)證結(jié)果及HandШ?jiǎn)蚊盖序?yàn)證圖譜

將 4株菌測(cè)得的序列應(yīng)用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的屎腸球菌 16S rRNA序列 (Accession No. AY675247)進(jìn)行相似性比較,同源性均為 99%,說明篩選的 4株菌經(jīng) 16S rRNA鑒定均為屎腸球菌。

2.3 屎腸球菌生長(zhǎng)代謝曲線測(cè)定結(jié)果

篩選所得的 4株屎腸球菌的生長(zhǎng)代謝結(jié)果如圖4所示。嬰兒糞便、乳豬腸道及糞便中所分離的屎腸球菌生長(zhǎng)代謝曲線基本相似,它們的生長(zhǎng)速度快,在4 h就進(jìn)入了對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,并持續(xù)到 14 h,14～18 h進(jìn)入穩(wěn)定期,18 h后進(jìn)入衰亡期。隨著菌體的生長(zhǎng),乳酸產(chǎn)量也逐漸升高,在 12 h后基本趨于穩(wěn)定。屎腸球菌生長(zhǎng)速度快,生長(zhǎng)周期短是其作為益生菌制劑的一個(gè)很大的優(yōu)勢(shì),為其作為仔豬飼料添加劑奠定了基礎(chǔ)。

圖4 4株屎腸球的生長(zhǎng)和代謝曲線

2.4 屎腸球菌抑菌能力測(cè)定結(jié)果

圖 5 4株屎腸球?qū)?5株指示菌的抑菌圈直徑

致病型大腸桿菌 K88,K99,金黃色葡萄球菌,巴氏桿菌及沙門氏菌是較為常見的引起仔豬腹瀉的致病菌。由圖 5可知,屎腸球菌對(duì)致病型大腸桿菌K88、K99、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌及沙門氏菌都有較強(qiáng)的抑制作用,抑菌圈直徑都在 11～23 mm之間,其中對(duì)大腸桿菌 K99的抑菌效果最好,抑菌圈直徑在 19～23 mm之間。這也是屎腸球菌作為益生菌制劑的一個(gè)必要的前提。

3 討論與結(jié)論

利用已經(jīng)過常規(guī)理化鑒定的、從嬰兒糞便、乳豬腸道及糞便中分離的 4株屎腸球菌,采用Biolog系統(tǒng)鑒定與 16S rRNA序列分析相結(jié)合的方法進(jìn)一步鑒定,確定這 4株菌均為屎腸球菌,結(jié)果表明所篩得菌株生長(zhǎng)速度快,均有很好的抑菌效果。Biolog系統(tǒng)鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)鑒定結(jié)果一致。與傳統(tǒng)鑒定方法相比,Biolog自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)快速、便捷、有效,特別是對(duì)于沒有目的性的未知微生物,Biolog系統(tǒng)可為鑒定者提供方向性指導(dǎo)。在利用 Biolog系統(tǒng)鑒定微生物時(shí),為獲得準(zhǔn)確的結(jié)果,在操作過程中需掌握很多關(guān)鍵因素,如適當(dāng)?shù)木鷳乙簼舛?適宜的培養(yǎng)溫度,消除菌懸液中的菌塊等,但首要條件是保證微生物的純粹性。由于 16S rRNA序列的保守性存在的普遍性,以及核酸序列本身的穩(wěn)定性定性、序列分析的重現(xiàn)性極高,基于當(dāng)今分析技術(shù)的改進(jìn),應(yīng)用 16S rRNA作為分子指標(biāo),可以實(shí)現(xiàn)快速、微量、準(zhǔn)確簡(jiǎn)便地對(duì)微生物進(jìn)行分類鑒定。分子分類正是在從研究的目的過渡到研究的手段。Biolog系統(tǒng)與 16S rRNA雙重鑒定更加說明鑒定結(jié)果的可靠性,而屎腸球菌的鑒定與篩選為開發(fā)新型微生態(tài)類飼料添加劑提供了幫助。

本研究證明了所篩選的屎腸球菌對(duì)致病型大腸桿菌 K88,K99,金黃色葡萄球菌,巴氏桿菌及沙門氏菌均具有很好的抑菌效果,但是后續(xù)工作還很多,如對(duì)所篩選的屎腸球菌的抗逆性進(jìn)行測(cè)定、選擇適宜的包埋方式及體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)飼養(yǎng)效果的評(píng)價(jià)等。

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Screening,Identification and Characterization of Enterococcus faeciumfor Feed Use

Wang Tingting1LiAike1Yi Jianming2Tao Haohan1Wang Yang1

(Academy of State Administration of Grain1,Beijing 100037)
(College ofAnimal Science and Technology,Hua ZhongAgriculturalUniversity2,Wuhan 430070)

Four new strainsof Enterococcus faecium were screened from healthy infant feces,piglet intestine and feces in EC medium,which were named as EfB,Ef1-2,Ef3-4 and Ef4-1.Theywere all identified asEnterococcus faeciumbyBiolog automatic microbe analysis system.16S rRNA identification comparingwith GenBank indicated thatthere was 99%homology withEnterococcus faeciumstrain SF(Accession No.AY675247).Results:All the four new strains have faster growth rate and can significantly inhibit growth of Escherichia coli K88,Escherichia coli K99, Staphylococcus Aureus,PasteurellosisB acillusandSalm onella,especiallyEscherichia coliK99.The identification results with t wo ways are consistent.The screening,identification and developmentof newEnterococcus faeciumwould be ben2 eficial for the development ofmicro-ecological agents for feed use.

Enterococcus faecium,Biolog automaticmicro-analysis system,identification by 16S rRNA,growth and metabolis m curve,bacteriostatic ability

Q93-331 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B 文章編號(hào):1003-0174(2010)03-0089-06

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2006BAD12B04),中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)課題(ZX0702)

2009-04-07

王婷婷,女,1985年出生,碩士,動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)

李愛科,男,1963年出生,研究員,動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)