趙 華,曾凡星,張 漓

4周低氧運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌mTOR/p70S6K通路的時(shí)程影響

趙 華1,2,曾凡星2,張 漓3

目的:研究4周低氧運(yùn)動(dòng)中mTOR/p70S6K通路的時(shí)程變化特征,以探討低氧訓(xùn)練中的蛋白合成代謝情況。方法:以12周齡雄性SD大鼠為研究對(duì)象,分為常氧安靜對(duì)照組(NS組)、常氧耐力運(yùn)動(dòng)組(NE組)、低氧安靜對(duì)照組(HS組)和低氧耐力運(yùn)動(dòng)組(HE組)。采用動(dòng)物跑臺(tái)訓(xùn)練,低氧刺激為常壓低氧(氧濃度13.6%,相當(dāng)于3 500 m海拔)。檢測(cè)大鼠趾長(zhǎng)伸肌的總蛋白含量及mTOR、p70S6K和p70S6K(Thr389)磷酸化表達(dá)。結(jié)果:在第3天時(shí),低氧因素對(duì)mTOR(P<0.05)和p70S6K(P<0.05)有顯著抑制效應(yīng)。在第7天時(shí),運(yùn)動(dòng)顯著促進(jìn)mTOR(P<0.01),而低氧顯著抑制 mTOR(P<0.01)和p70S6K(P<0.01)。在第14天時(shí),低氧顯著抑制mTOR(P<0.01)和p70S6K(Thr389)磷酸化(P<0.01),而運(yùn)動(dòng)顯著促進(jìn)p70S6K(P<0.01)。在第28天時(shí),低氧顯著抑制mTOR(P<0.05)和p70S6K(Thr389)磷酸化(P<0.01),而運(yùn)動(dòng)顯著地促進(jìn)了 mTOR(P<0.01)和p70S6K(P<0.05)。結(jié)論:耐力運(yùn)動(dòng)促進(jìn)mTOR/p70S6K通路的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)肌肉蛋白合成;單純低氧暴露可通過(guò)抑制mTOR/ p70S6K表達(dá),而抑制肌肉蛋白合成;低氧耐力運(yùn)動(dòng)可削弱低氧對(duì) mTOR/p70S6K表達(dá)的抑制作用。低氧運(yùn)動(dòng)對(duì)mTOR及p70S6K的影響有時(shí)程變化,且有時(shí)程差異。

低氧運(yùn)動(dòng);蛋白合成;mTOR;p70S6K;鼠;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

低氧訓(xùn)練在現(xiàn)代的訓(xùn)練中使用越來(lái)越廣泛,但低氧訓(xùn)練本身是有利有弊的。高原訓(xùn)練后骨骼肌蛋白丟失,肌纖維橫徑縮小、肌肉萎縮,且肌細(xì)胞凋亡加劇。在超過(guò)一定海拔高度進(jìn)行訓(xùn)練時(shí),低氧因素對(duì)機(jī)體的刺激占主要地位[4,5]。肌纖維為應(yīng)對(duì)低氧來(lái)增強(qiáng)其利用氧的速度,常變得纖細(xì),從而造成肌肉形態(tài)上一定程度的萎縮。肌肉質(zhì)量丟失比較大,造成力量的丟失,影響運(yùn)動(dòng)能力的發(fā)揮。而目前對(duì)于低氧運(yùn)動(dòng)中蛋白丟失的機(jī)制仍不清楚。

近些年來(lái)的一些研究為解決這些問(wèn)題提供了良好思路?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有許多條通路調(diào)控蛋白代謝,如 Ras/ MAPK通路、PI3 K-Akt-mTOR通路、Calcineurin/NFAT通路、MEK/ERK/p90RSK、AMPK通路等,它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)部構(gòu)成一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),互相影響。在這些調(diào)控肌肉蛋白合成信號(hào)通路中起著核心作用的,就是雷帕霉素靶蛋白 (themammalian target of rapamycin,mTOR)通路[12,13,16,17,29,31,34],對(duì)mTOR通路的抑制能阻斷95%的肌肉肥大效應(yīng)[13]。近來(lái)被認(rèn)為是骨骼肌蛋白合成生物標(biāo)志物的,即mTOR信號(hào)通路中一個(gè)重要構(gòu)成——p70核蛋白S6激酶(p70 ribosomal S6 kinase,p70S6K)[15,19,22-24]。本研究從主要的蛋白合成通路mTOR/p70S6K通路在低氧運(yùn)動(dòng)中的時(shí)程變化特征,研究低氧訓(xùn)練中蛋白合成情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)9周齡雄性 SD鼠,體重220±20 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料,分籠飼養(yǎng),自由飲食,溫度維持在23℃～25℃,相對(duì)濕度40%～60%。

動(dòng)物在常氧條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后,再進(jìn)行17天的水平跑臺(tái)遞增負(fù)荷適應(yīng)性訓(xùn)練,強(qiáng)度從20 m/min逐漸過(guò)渡到35 m/min,每天遞增1～2 m/min。將體重過(guò)重和過(guò)輕、力竭運(yùn)動(dòng)能力太好和太壞及有傷病的大鼠剔除,然后挑選出130只實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行正式訓(xùn)練。

130只SD鼠共分為13個(gè)組(表1),每組10只,各組體重?zé)o顯著性差異。隨機(jī)分為常氧安靜對(duì)照組(NS)、低氧安靜對(duì)照組(HS)、常氧耐力運(yùn)動(dòng)組(NE)和低氧耐力運(yùn)動(dòng)組(HE)。實(shí)驗(yàn)中使用的低氧發(fā)生設(shè)備為國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所低氧試驗(yàn)室的CTDY-200型高溫高濕低氧訓(xùn)練系統(tǒng)。低氧組大鼠在該系統(tǒng)的動(dòng)物低氧室內(nèi)模擬低氧(常壓低氧:氧含量13.6%,模擬海拔高度3 500 m)條件下生活訓(xùn)練。

1.2 實(shí)驗(yàn)安排

正式實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物訓(xùn)練安排如表2所示。

表1 本研究動(dòng)物分組一覽表Table 1. Animal G rouping

表2 本研究動(dòng)物訓(xùn)練計(jì)劃一覽表Table 2. The Training Plan of Animals

1.3 儀器設(shè)備和試劑

1.3.1 儀器設(shè)備

Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司),Ultra Bacis pH Meter(UB-7)型pH計(jì)(Sartorius公司),AL104型精密天平(Mettler T oledo公司),GS-15R低溫高速離心機(jī)(Beckman公司),Mini-PROTEAN電泳槽(Bio-Rad公司), DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠),DYCZ-40C型碳板轉(zhuǎn)移電流槽(北京六一儀器廠),CTDY-200型高溫高濕低氧訓(xùn)練系統(tǒng)等。其他儀器如磁力攪拌器、恒溫振蕩器、真空泵、752型分光光度計(jì)、培養(yǎng)箱等均為國(guó)產(chǎn)。

1.3.2 試劑

NC膜購(gòu)自 GE公司;Tris、SDS、過(guò)硫酸胺、溴酚蘭購(gòu)自Sigma公司;丙烯酰胺、Tween-20購(gòu)自 Genview公司;亞甲雙丙烯酰胺、考馬斯亮蘭(R-250)購(gòu)自USB公司;TEMED購(gòu)自Amersco公司;L-甘氨酸購(gòu)自Japan公司;蛋白彩色預(yù)染Marker(7-175 kDa)購(gòu)自NEB公司;RIPA裂解液、PMSF購(gòu)自碧云天公司;SuperSignal○RWest Pico Chemiluminescent Substrate購(gòu)自 Pierce公司;蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑購(gòu)自 Roche公司;mTOR、p70S6K和p70S6K(Thr389)磷酸化抗體均購(gòu)自Cell Signaling公司,內(nèi)參actin(I-19)-R購(gòu)自Santa Cruz公司。二抗[IgG、Fc、X-Adsorbed(HRP)]購(gòu)自USBiological公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 體重指標(biāo)測(cè)試

體重的測(cè)試于實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)第4天、7天、14天、28天測(cè)試。測(cè)試前禁水、禁食12 h,均于當(dāng)天清晨進(jìn)行測(cè)試。

1.4.2 動(dòng)物組織提取

取材前禁水、禁食12 h,以0.3 ml/100 g為劑量,腹腔注射10%水合氯醛麻醉。麻醉后腹主動(dòng)脈取血,然后速取后肢趾長(zhǎng)伸肌(EDL肌)。接著用生理鹽水將其洗凈,剔除肌腱及筋膜組織,用干凈濾紙將其吸干,用錫紙將其包裹后迅速投入液氮,而后置于-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.4.3 提取蛋白

勻漿緩沖液的配制:取RIPA裂解液100 ml,分別加入蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑各10片,最后取100 mM PMSF 1 000μl加入。PMSF于臨用前數(shù)分鐘加入。于勻漿前新鮮配制。

用精密天平稱取趾長(zhǎng)伸肌(EDL肌)120 mg,用眼科剪迅速剪碎,按1∶10比例向玻璃勻漿器中加入預(yù)冷的裂解液,再在冰水浴中進(jìn)行勻漿,直至沒(méi)有肉眼可視的懸浮物。將組織勻漿液倒入1.5 ml EP管中,靜置10 min。于4℃, 12 000 g,10 min離心,取上清液,分裝后保存于-80℃待測(cè)。

1.4.4 蛋白濃度測(cè)試(Bradford法)

配制Bradford工作液:按照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[1]配制。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:用1 mg/ml BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白分配制0、10、20、40、60、80、100μg梯度。加入 5 ml Bradford工作液,用旋渦混勻器混勻后靜置5 min。測(cè)A595nm。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線后,再分批次測(cè)試樣品濃度。

1.4.5 Western Blot測(cè)試

Tris-甘氨酸電泳緩沖液、上樣緩沖液、電轉(zhuǎn)液、堆積膠和分離膠的配制均參照《Current Protocols in Protein Science》[13],TBS、TBST、封閉液按照Cell Signaling抗體說(shuō)明書(shū)的要求配制。

取60μg總蛋白配制上樣緩沖體系,置100℃沸水中5 min。配制6%的分離膠(mTOR)或8%的分離膠[Actin、p70S6K、p70S6K(Thr389)]。上膠用80 V恒壓,下膠換 120 V恒壓電。再用半干轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上,以恒壓20 V 90 min電轉(zhuǎn)。封閉90 min后用一抗孵育,不同抗體稀釋比例分別為actin(購(gòu)自Santa Cruz公司)為1∶1 000,mTOR (購(gòu)自 Cell Signaling公司)為 1∶1 000,p70S6K抗體(購(gòu)自Cell Signaling公司)為1∶1 000,Phospho-p70S6K(Thr389) (購(gòu)自Cell Signaling公司)為1∶1 200,孵育過(guò)夜。次日晨在用 TBST洗膜后用二抗(1∶16 000)孵育60 min。用ECL發(fā)光試劑反應(yīng),曝光底片用Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)用透光拍照,用Quantity One圖像分析系統(tǒng)分析。將每個(gè)條帶與相應(yīng)樣品的Actin條帶光密度值進(jìn)行比較,計(jì)算出目的條帶的相對(duì)含量值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對(duì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的數(shù)據(jù)處理運(yùn)用 SPSS 13.0軟件。組間比較采用雙因素方差分析(UNIANOVA)和單因素方差分析(One-Way ANOVA)。對(duì)觀測(cè)點(diǎn)的組間多重比較(Post Hoc)采用LSD或 Tamhane’s T2方法分析。顯著性檢驗(yàn)水平以 P<0.05表示具有顯著性差異,P<0.01表示具有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 低氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠體重的影響

分別于實(shí)驗(yàn)前、第3天、7天、14天、21天、28天給大鼠稱重(表3),稱重前禁水、禁食12 h,稱重后立即恢復(fù)飲食。

表3 本研究大鼠體重不同時(shí)程低氧運(yùn)動(dòng)的變化一覽表 (g)Table 3. Change of Body Weight of Rat at Different Time Course of Hypoxic Training

圖1 本研究大鼠體重時(shí)程圖Figure 1. Time Course Diagram of Body Weight of Rat

體重總體趨勢(shì)(圖1):各組別大鼠體重隨時(shí)程變化而逐漸增加。其中,HS組在第3天時(shí)有體重降低的現(xiàn)象,而隨后其一直保持增加?？偟膩?lái)說(shuō),NS組最高,其次為 HS組,再次為NE組,最后為 HE組。在第7天后,這種趨勢(shì)尤為明顯。在總體上就運(yùn)動(dòng)和低氧兩個(gè)因素而言,運(yùn)動(dòng)因素(P<0.01)對(duì)體重有顯著性減少作用,而低氧因素(P> 0.05)對(duì)其也有抑制,但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。

實(shí)驗(yàn)前,各組大鼠體重間無(wú)顯著差異(P>0.05);第3天時(shí),HE組顯著高于 HS組(P<0.05);第7天時(shí),各組間體重?zé)o顯著性差異(P>0.05);第14天時(shí),HE組最低,顯著低于NS組(P<0.01)和 HS組(P<0.05),而NS組(P <0.05)顯著高于NE組;第21天時(shí),各組間關(guān)系與第14天一致;第28天時(shí),NS組最高,非常顯著高于NE組(P< 0.01)和 HE組(P<0.01),HS組也非常顯著高于NE組(P<0.01)和 HE組(P<0.01)。在第28天時(shí),HE組比NS組低17.1%,NE組比NS組低12.3%,HS組比NS組低4.8%。

2.2 第 3天時(shí)體重、蛋白含量、mTOR、p70S6K和 p70S6K(Thr389)磷酸化指標(biāo)的變化

在第3天時(shí),運(yùn)動(dòng)和低氧對(duì)體重的影響均未達(dá)到顯著性差異(P>0.05),但運(yùn)動(dòng)有促進(jìn)趨勢(shì),低氧有抑制趨勢(shì)。HS組體重顯著低于 HE組(94.6%,P<0.05)。運(yùn)動(dòng)和低氧對(duì)蛋白含量的影響未達(dá)到顯著性差異(P>0.05),但運(yùn)動(dòng)有促進(jìn)趨勢(shì),低氧有抑制趨勢(shì)。低氧(P<0.05)顯著抑制mTOR,運(yùn)動(dòng)未達(dá)到顯著性差異(P>0.05),但有促進(jìn)的趨勢(shì)。NE組mTOR蛋白表達(dá)顯著高于 HS組(108.7%,P <0.05)和 HE組(111.3%,P<0.05)。低氧(P<0.05)顯著抑制p70S6K,運(yùn)動(dòng)未達(dá)到顯著性差異(P>0.05),但有促進(jìn)的趨勢(shì)。NE組p70S6K蛋白表達(dá)非常顯著高于 HS組(120.2%,P<0.01),顯著高于 HE組(114.0%,P< 0.05)。低氧和運(yùn)動(dòng)對(duì)p70S6K(Thr389)磷酸化的影響未達(dá)到顯著性差異(P>0.05),運(yùn)動(dòng)有促進(jìn)的趨勢(shì),低氧有抑制的趨勢(shì)。NE組p70S6K(Thr389)磷酸化顯著高于 HS組(126.8%,P<0.05;圖2)。

在第3天時(shí),低氧因素對(duì) mTOR(P<0.05)和p70S6K(P<0.05)有顯著抑制效應(yīng),而對(duì)p70S6K(Thr389)未達(dá)到顯著性差異(P>0.05)。運(yùn)動(dòng)因素對(duì)這3個(gè)信號(hào)蛋白分子都沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響(P>0.05),但有促進(jìn)的趨勢(shì)。而低氧因素和運(yùn)動(dòng)因素對(duì)蛋白含量和體重的影響均未達(dá)到顯著效應(yīng)。

2.3 第 7天時(shí)體重、蛋白含量、mTOR、p70S6K和 p70S6K(Thr389)磷酸化指標(biāo)的變化

在第7天,低氧和運(yùn)動(dòng)對(duì)體重的影響仍未達(dá)到顯著性差異(P>0.05),但均表現(xiàn)出抑制的趨勢(shì)。低氧因素(P< 0.01)顯著抑制蛋白含量,運(yùn)動(dòng)因素(P>0.05)雖沒(méi)有顯著影響蛋白含量,但有促進(jìn)的趨勢(shì)。NE組蛋白含量非常顯著高于 HS組(109.7%,P<0.01)和 HE組(111.6%, P<0.01)。運(yùn)動(dòng)因素(P<0.01)和低氧因素(P<0.01)對(duì)mTOR的影響均達(dá)到非常顯著性差異,運(yùn)動(dòng)顯著促進(jìn)mTOR,低氧顯著抑制mTOR。NE組mTOR蛋白表達(dá)非常顯著高于 HS組(128.2%,P<0.01),顯著高于 HE組(111.4%,P<0.05),HE組非常顯著高于 HS組(115.1%,P<0.01)。低氧因素(P<0.01)非常顯著抑制p70S6K,運(yùn)動(dòng)因素(P>0.05)對(duì)p70S6K的影響雖未達(dá)顯著性,但有促進(jìn)的趨勢(shì)。NE組p70S6K蛋白表達(dá)顯著高于 HS組(113.2%,P<0.05),非常顯著高于 HE組(125.1%,P <0.01)。運(yùn)動(dòng)(P>0.05)和低氧(P>0.05)均未顯著影響p70S6K(Thr389)磷酸化,但運(yùn)動(dòng)有促進(jìn)趨勢(shì),低氧有抑制趨勢(shì)(圖3)。

表4 本研究第3天時(shí)大鼠各指標(biāo)值一覽表Table 4. Time Course Change of Protein Content,mTOR,p70S6Kand p70S6K(Thr389)at 3rd day

表5 本研究第7天時(shí)各指標(biāo)值一覽表Table 5. Time Course Change of Protein Content,mTOR,p70S6Kand p70S6K(Thr389)at 7th day

在第7天時(shí),運(yùn)動(dòng)非常顯著促進(jìn)mTOR的表達(dá)(P< 0.01),低氧對(duì) mTOR的抑制仍具有顯著性(P<0.01)。低氧也對(duì)p70S6K有顯著抑制(P<0.01),而運(yùn)動(dòng)只表現(xiàn)出促進(jìn)的趨勢(shì)(P>0.05)。低氧和運(yùn)動(dòng)對(duì)p70S6K(Thr389)的影響還未達(dá)顯著差異(P>0.05)。就蛋白含量來(lái)說(shuō),低氧對(duì)其有非常顯著的抑制(P<0.01),而運(yùn)動(dòng)對(duì)其影響不顯著(P>0.05)。低氧和運(yùn)動(dòng)對(duì)蛋白含量和體重的影響均未達(dá)到顯著效應(yīng)。

2.4 第14天時(shí)體重、蛋白含量、mTOR、p70S6K和p70S6K(Thr389)磷酸化指標(biāo)的變化

圖3 第7天觀測(cè)點(diǎn)各指標(biāo)組間比較圖Figure 3. Comparison on Diagram of Indexes of Each G roup at 7th Day

表6 本研究第14天時(shí)各指標(biāo)值一覽表Table 6. Time Course Change of Protein Content,mTOR,p70S6Kand p70S6K(Thr389)at 14th day

在第14天,運(yùn)動(dòng)因素(P<0.01)顯著抑制體重,低氧因素(P>0.05)對(duì)體重的影響雖未表現(xiàn)出顯著性,但有抑制趨勢(shì)。HE組體重顯著低于 HS組(91.9%,P< 0.05)。運(yùn)動(dòng)因素(P<0.01)非常顯著地促進(jìn)蛋白含量性差異,低氧因素(P>0.05)雖未達(dá)到顯著性差異,但有抑制趨勢(shì)。NE組 (121.2%,P<0.01)和 HE組 (117.4%,P<0.01)蛋白含量均顯著高于 HS組。低氧因素(P<0.01)顯著抑制mTOR,運(yùn)動(dòng)因素(P>0.05)對(duì)mTOR的影響雖未表現(xiàn)出顯著性,但有促進(jìn)趨勢(shì)。NE組mTOR蛋白表達(dá)非常顯著高于 HS組(127.1%,P< 0.01)和 HE組(123.1%,P<0.01)。運(yùn)動(dòng)因素(P< 0.01)顯著促進(jìn) p70S6K,低氧因素(P>0.05)對(duì) p70S6K的影響雖未表現(xiàn)出顯著性,但有抑制趨勢(shì)。NE組(158.1%,P<0.01)和 HE組(152.2%,P<0.01)p70S6K蛋白表達(dá)均非常顯著高于 HS組。低氧因素(P<0.01)顯著抑制p70S6K(Thr389),運(yùn)動(dòng)因素(P>0.05)對(duì)p70S6K(Thr389)的影響雖未表現(xiàn)出顯著性,但有促進(jìn)趨勢(shì)。NE組 p70S6K(Thr389)磷酸化均非常顯著高于 HS組(168.9%,P<0.01)和 HE組(147.8%,P<0.01;圖4)。

在第14天時(shí),低氧非常顯著抑制mTOR蛋白表達(dá)(P <0.01)和p70S6K(Thr389)磷酸化(P<0.01),而運(yùn)動(dòng)非常顯著促進(jìn)p70S6K蛋白表達(dá)(P<0.01)。對(duì)于蛋白含量,運(yùn)動(dòng)非常顯著促進(jìn)了它的增加(P<0.01),低氧對(duì)其影響不明顯(P>0.05)。運(yùn)動(dòng)因素對(duì)體重的抑制表現(xiàn)出非常顯著性(P<0.01),而低氧未表現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05)。

2.5 第28天時(shí)體重、蛋白含量、mTOR、p70S6K和p70S6K

在第28天,運(yùn)動(dòng)因素(P<0.01)非常顯著抑制體重,低氧因素(P>0.05)對(duì)體重的影響雖未表現(xiàn)出顯著性,但有抑制趨勢(shì)。NE組(87.7%,P<0.01)和 HE組(82.9%,P<0.01)體重均非常顯著低于NS組,HE組顯著低于 HS組(92.1%,P<0.01)。運(yùn)動(dòng)因素(P<0.05)顯著促進(jìn)蛋白含量增加,低氧因素(P>0.05)對(duì)其影響雖未達(dá)到顯著性,但表現(xiàn)出抑制的趨勢(shì)。運(yùn)動(dòng)因素和低氧因素對(duì)mTOR的影響明顯,運(yùn)動(dòng)因素(P<0.01)非常顯著地促進(jìn)mTOR,而低氧因素(P<0.05)顯著地抑制mTOR。NE組(128.5%,P<0.05)和 HE組(120.6%, P<0.05)mTOR蛋白表達(dá)均顯著高于 HS組。運(yùn)動(dòng)因素(P<0.01)非常顯著地促進(jìn)p70S6K蛋白表達(dá),低氧因素(P>0.05)對(duì)p70S6K的影響沒(méi)有達(dá)到顯著性,但有抑制的趨勢(shì)。NE組 p70S6K蛋白表達(dá)非常顯著高于 NS組(141.0%,P<0.01)和 HS組(141.8%,P<0.01),顯著高于 HE組(110.9%,P<0.05),HE組非常顯著高于HS組(127.9%,P<0.01)和 NS組 (127.1%,P< 0.01)。低氧因素(P<0.01)顯著地抑制 p70S6K(Thr389)磷酸化,運(yùn)動(dòng)因素(P>0.05)對(duì)p70S6K(Thr389)磷酸化的影響沒(méi)有達(dá)到顯著性,但有促進(jìn)的趨勢(shì)。NE組p70S6K(Thr389)磷酸化非常顯著高于 HS組(141.1%,P<0.01),顯著高于 HE組(118.6%,P<0.05),NS組非常顯著高于HS組(149.5%,P<0.01)和 HE組(125.7%,P<0.01),HE組顯著高于 HS組(118.9%,P<0.05;圖5)。

表7 本研究第28天時(shí)各指標(biāo)值一覽表Table 7. Time Course Change of Protein Content,mTOR,p70S6Kand p70S6K(Thr389)at 28th day

在第28天時(shí),低氧顯著抑制 mTOR蛋白表達(dá)(P< 0.05)和p70S6K(Thr389)磷酸化(P<0.01),而運(yùn)動(dòng)非常顯著地促進(jìn)了 mTOR蛋白表達(dá)(P<0.01)和顯著地促進(jìn)p70S6K(P<0.05)。對(duì)于蛋白含量,運(yùn)動(dòng)顯著地促進(jìn)了它的增加(P<0.05),低氧對(duì)其影響不明顯(P>0.05)。運(yùn)動(dòng)因素對(duì)體重的抑制達(dá)到非常顯著性(P<0.01),而低氧未表現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 低氧運(yùn)動(dòng)抑制體重的增加

本研究結(jié)果表明,低氧和運(yùn)動(dòng)兩個(gè)因素對(duì)體重都有很強(qiáng)的抑制效應(yīng)。這與賀道遠(yuǎn)[2]、黃徐根[3]等的研究一致。在第28天后,NS組大鼠的體重高于 HS組,而 HE組和NE組與NS組相比,則都是非常顯著減少了體重,其中, HE組的變化更為顯著。在第28天時(shí),HE組和NE組體重顯著低于NS組(分別為82.9%和87.7%),HE組顯著低于 HS組(92.1%)。說(shuō)明低氧能加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)對(duì)體重抑制效應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)的第3天時(shí),HS組有個(gè)突然的降低現(xiàn)象(-1.7%),而隨后的時(shí)間里一直保持增加的勢(shì)頭。這可能是由于剛暴露于低氧環(huán)境時(shí),低氧對(duì)機(jī)體的負(fù)面刺激比較大,可能會(huì)引起內(nèi)分泌一定的紊亂,造成機(jī)體的分解代謝加強(qiáng)。劉曄(2000)[4]在大鼠模擬4 000 m高原中,發(fā)現(xiàn)1周后比平原對(duì)照組睪酮低了58.5%,而2周后回升,但仍比平原低。同時(shí)基礎(chǔ)代謝也增強(qiáng),造成了體重的下降。而同時(shí)程的 HE組大鼠體重卻表現(xiàn)出增加了4.1%,之后一直保持緩慢增加,但增加的幅度沒(méi)有 HS組多。HE組此時(shí)體重的增加可能與運(yùn)動(dòng)引起機(jī)體一些內(nèi)分泌的調(diào)整,抵消了部分的分解代謝反應(yīng),提高了機(jī)體對(duì)食物和水的攝取有關(guān)。

低氧運(yùn)動(dòng)抑制體重,主要是由于低氧引起能量物質(zhì)的大量消耗及其對(duì)AMPK的激活。低氧本身則因?yàn)樵斐闪四芰繎?yīng)激,進(jìn)一步加劇運(yùn)動(dòng)對(duì)AMPK的激活。而后者的表達(dá)可顯著增強(qiáng)機(jī)體對(duì)脂肪酸的氧化。Steinberg(2006)[27]發(fā)現(xiàn),AMPK在調(diào)控脂肪酸、甘油三酯和膽固醇的調(diào)控中起著核心作用。AMPK能通過(guò)ACC增強(qiáng)脂肪酸的氧化,通過(guò) HMGR影響膽固醇的合成,通過(guò) GPAT影響甘油三酯的合成。Lee(2006)[20]觀察到,AMPK的激活能顯著增加骨骼肌脂肪酸的氧化,短期內(nèi)是通過(guò)肌肉內(nèi)乙酰CoA的濃度來(lái)達(dá)到的,而在AMPK的長(zhǎng)期激活對(duì)減少機(jī)體的脂肪中,主要是由于AMPK激活了PPARαmRNA和PGC-1 mRNA的基因表達(dá)。此外,低氧環(huán)境中機(jī)體的呼吸活動(dòng)加強(qiáng),呼吸的加快引起體內(nèi)水的排出增加,這也可能是引起體重減輕的原因之一。

3.2 低氧運(yùn)動(dòng)對(duì)蛋白合成及mTOR/p70S6K通路的效應(yīng)

運(yùn)動(dòng)具有很強(qiáng)的促肌肉蛋白合成效應(yīng),但在運(yùn)動(dòng)的過(guò)程中,蛋白合成相關(guān)的信號(hào)一般都被抑制,致使蛋白合成過(guò)程處于劣勢(shì),而在運(yùn)動(dòng)后蛋白的合成才增加。在抗阻練習(xí)過(guò)程中AMPK的激活和mTOR通路蛋白磷酸化的減少是抑制蛋白合成的主要原因。但是,在運(yùn)動(dòng)后1～2 h時(shí),骨骼肌蛋白合成由于Akt、mTOR、p70S6K和eEF2的激活而迅速增加。運(yùn)動(dòng)的促合成效應(yīng)都能持續(xù)到運(yùn)動(dòng)后數(shù)天[14]。Hernandez(2000)[18]對(duì)一次急性力量練習(xí)后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了研究,同樣發(fā)現(xiàn)腓腸肌蛋白合成在運(yùn)動(dòng)后一段時(shí)間內(nèi)一直處于抑制,而直到運(yùn)動(dòng)后12 h才逐漸增加,且這種增加在24 h仍保持增加。而長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)后,蛋白合成效應(yīng)能產(chǎn)生一種積累效應(yīng)。不管是抗阻力量練習(xí),還是耐力練習(xí),均能有效改善肌肉狀態(tài),促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育。Short(2004)[26]在 16周的耐力練習(xí)后肌肉蛋白合成增加了22%,并且這種效應(yīng)不受年齡和性別的影響。Baar(1999)[9]對(duì)Wistar大鼠用高頻電刺激持續(xù)6周,結(jié)果發(fā)現(xiàn) EDL肌重量增加了 13.9%,TA肌增加了14.4%。

圖5 第28天觀測(cè)點(diǎn)各指標(biāo)組間比較圖Figure 5. Comparison on Diagram of Indexes of E ach G roupat 28th Day

低氧中氧供減少,氧化磷酸化過(guò)程抑制,ATP生成減少,造成機(jī)體的能荷降低,激活 AMPK。而后者會(huì)激活TSC1/TSC2復(fù)合體的活性,進(jìn)而抑制mTOR通路,引起蛋白合成的明顯抑制。在機(jī)體氧供減少時(shí),機(jī)體的“氧氣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)子”——HIF激活后,刺激 REDD1的表達(dá),由后者激活 TSC1/TSC2復(fù)合體,而后者對(duì)mTOR是起抑制作用的。

在本研究中,運(yùn)動(dòng)因素顯著促進(jìn)蛋白含量,而低氧因素對(duì)蛋白含量卻有顯著的抑制。在第3天,NE組和 HE組均高于 HS組,但沒(méi)有顯著性差異;第7天時(shí)NE組非常顯著高于 HS組和 HE組。而在第14天時(shí),HE組和NE組均非常顯著高于HS組。在第28天時(shí),各組蛋白濃度間差異不顯著。通常是NE組最高,其次為 HE組,HS組最低。說(shuō)明長(zhǎng)期的低氧抑制蛋白含量,而長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)能部分抵消低氧因素對(duì)蛋白含量的抑制。

在本研究中也發(fā)現(xiàn),低氧明顯抑制了 mTOR信號(hào)通路。在低氧暴露的第3天時(shí),mTOR蛋白表達(dá)和p70S6K蛋白表達(dá)均發(fā)生了顯著的抑制,而運(yùn)動(dòng)的促進(jìn)效應(yīng)還不明顯,它對(duì)mTOR通路各信號(hào)分子只是有促進(jìn)的趨勢(shì),但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。表明此階段低氧對(duì)機(jī)體的刺激尤為明顯,機(jī)體動(dòng)員內(nèi)部以抵抗氧供不足對(duì)機(jī)體的負(fù)面影響。此時(shí),運(yùn)動(dòng)因素和低氧對(duì)蛋白含量都沒(méi)有產(chǎn)生顯著性的影響,各組間的蛋白含量值差不多。這表明信號(hào)分子的變化到引起肌肉形態(tài)上的變化需要一段時(shí)間。

而在第7天時(shí),低氧非常顯著性地抑制了蛋白含量,表明此階段低氧對(duì)蛋白合成的負(fù)面效應(yīng)已經(jīng)表現(xiàn)為形態(tài)上的變化,引起蛋白含量的顯著減少。但由于機(jī)體仍處于低氧適應(yīng)的早期,低氧對(duì)機(jī)體的刺激仍非常明顯。低氧非常顯著性地抑制了mTOR蛋白表達(dá)和p70S6K蛋白表達(dá),而同時(shí)運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體蛋白合成的促進(jìn)效應(yīng)開(kāi)始顯現(xiàn)。雖然運(yùn)動(dòng)因素雖未明顯促進(jìn)蛋白含量的增加,但仍保持促進(jìn)的趨勢(shì)。運(yùn)動(dòng)對(duì)mTOR蛋白表達(dá)的促進(jìn)達(dá)到非常顯著性差異。運(yùn)動(dòng)因素對(duì)p70S6K蛋白表達(dá)和p70S6K磷酸化仍保持促進(jìn)的趨勢(shì)。

低氧暴露14天時(shí),機(jī)體對(duì)低氧有了相當(dāng)?shù)倪m應(yīng)。低氧對(duì)蛋白含量的抑制效果未達(dá)到顯著性差異,它對(duì)機(jī)體蛋白合成的抑制不像先前那么明顯,但卻仍表現(xiàn)出對(duì)mTOR的抑制效應(yīng)。此階段,運(yùn)動(dòng)因素對(duì)機(jī)體蛋白合成的促進(jìn)效果非常明顯,它對(duì)蛋白含量的影響達(dá)到非常顯著性差異,表明此階段運(yùn)動(dòng)因素的促合成效應(yīng)已經(jīng)超過(guò)低氧因素的抑制效應(yīng)。同時(shí),它對(duì)p70S6K蛋白表達(dá)的促進(jìn)效應(yīng)有顯著性差異。運(yùn)動(dòng)因素對(duì)mTOR和p70S6K(Thr389)磷酸化表達(dá)的促進(jìn)效應(yīng)雖未達(dá)到顯著性差異,但仍保持促進(jìn)的趨勢(shì)。

低氧暴露28天對(duì)機(jī)體來(lái)說(shuō)是個(gè)適應(yīng)期的中后期,低氧對(duì)蛋白含量的抑制效果未達(dá)到顯著性差異,它對(duì)機(jī)體蛋白合成的抑制不像先前那么明顯,但卻仍表現(xiàn)出對(duì)mTOR蛋白表達(dá)和p70S6K(Thr389)磷酸化的抑制效應(yīng)。而與此同時(shí),運(yùn)動(dòng)因素表現(xiàn)為顯著地促進(jìn)蛋白含量的增加,而低氧因素對(duì)蛋白含量的影響未達(dá)到顯著性效應(yīng),表明此階段運(yùn)動(dòng)因素的促合成效應(yīng)跟第14天的效應(yīng)一樣,仍保持超過(guò)低氧因素的負(fù)面效應(yīng)。此階段中,運(yùn)動(dòng)因素對(duì)mTOR蛋白表達(dá)和p70S6K蛋白表達(dá)表現(xiàn)出非常顯著性的促進(jìn),而對(duì)于p70S6K(Thr389)磷酸化仍保持促進(jìn)的趨勢(shì)。

在實(shí)驗(yàn)的整個(gè)時(shí)程里,運(yùn)動(dòng)因素對(duì)mTOR蛋白表達(dá)、p70S6K蛋白表達(dá)及其磷酸化三者都表現(xiàn)出促進(jìn)的效應(yīng),而低氧因素對(duì)這三者都表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。只不過(guò)在不同的階段,低氧因素和運(yùn)動(dòng)因素二者所起作用的程度略有不同而已。

3.3 低氧運(yùn)動(dòng)對(duì)mTOR/p70S6K通路表達(dá)的時(shí)程效應(yīng)

在實(shí)驗(yàn)的整個(gè)時(shí)程里,運(yùn)動(dòng)因素對(duì)蛋白合成和mTOR通路表現(xiàn)出促進(jìn)的效應(yīng),而低氧因素表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。在不同的時(shí)程中,這兩個(gè)因素所起作用的程度略有不同。在低氧適應(yīng)的早期,低氧對(duì)機(jī)體的抑制效應(yīng)占優(yōu)勢(shì),而在中后期,運(yùn)動(dòng)因素的促合成效應(yīng)表現(xiàn)得尤為明顯。所以,最終表現(xiàn)為低氧因素明顯地抑制了蛋白合成,而運(yùn)動(dòng)則顯著地促進(jìn)了蛋白合成。

在本研究中發(fā)現(xiàn),低氧明顯抑制了mTOR信號(hào)通路,尤其是在低氧暴露早期階段。此時(shí),運(yùn)動(dòng)對(duì)該通路促進(jìn)效應(yīng)的表現(xiàn)還不明顯。表明機(jī)體在此階段可能是低氧的應(yīng)激對(duì)機(jī)體的影響占主要地位。機(jī)體的降解過(guò)程、細(xì)胞凋亡過(guò)程可能比較強(qiáng)。低氧情況下能增強(qiáng)機(jī)體 HIF的活性[25],通過(guò)作用于BNIP3等因子,促進(jìn)機(jī)體的細(xì)胞凋亡過(guò)程[8,28]。HIF還能通過(guò)刺激 REDD1的表達(dá),增強(qiáng) TSC1/ TSC2的活性,進(jìn)而抑制mTOR的活性,影響mRNA的翻譯。低氧也造成一種能量應(yīng)激,通過(guò)加強(qiáng)AMPK的活性,后者通過(guò)作用于 TSC1/TSC2而抑制mTOR活性。

而到了中后期時(shí),機(jī)體對(duì)低氧逐漸產(chǎn)生了適應(yīng),低氧對(duì)機(jī)體造成的影響隨之降低。雖然低氧對(duì)mTOR仍有相當(dāng)?shù)囊种?但運(yùn)動(dòng)的促合成效應(yīng)逐漸表現(xiàn)出來(lái)。表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)明顯促進(jìn)mTOR和p70S6K的蛋白表達(dá),而低氧對(duì)這兩個(gè)信號(hào)分子的由于抑制而顯得較低。HE組對(duì)mTOR的蛋白表達(dá)在中后期時(shí),始終高于 HS組,在第28天時(shí)達(dá)到顯著差異。而對(duì)p70S6K的蛋白表達(dá),HE組即已非常顯著高于 HS組。運(yùn)動(dòng)可增強(qiáng)低氧環(huán)境中mTOR的活性,部分抵消低氧對(duì)該通路的抑制效應(yīng),從而促進(jìn)蛋白合成。

3.4 4周低氧運(yùn)動(dòng)中mTOR與p70S6K的表達(dá)有時(shí)程差異

在本研究中,運(yùn)動(dòng)因素對(duì)mTOR通路表現(xiàn)出促進(jìn)的效應(yīng),而低氧因素表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。但在許多階段中,mTOR蛋白表達(dá)、p70S6K蛋白表達(dá)及其磷酸化三者與蛋白表達(dá)的表現(xiàn)有不平行的地方。mTOR蛋白表達(dá)剛開(kāi)始時(shí)升高并不顯著,但在第7天后一直保持升高的趨勢(shì)。p70S6K蛋白表達(dá)基本保持升高的趨勢(shì),其中,HS組為先升高、再降低、后又升高,HS組和 HE組的p70S6K是第7天左右即開(kāi)始下降,而NE組是在第14天時(shí)才下降。這表明p70S6K的激活似乎受到了其他因素的影響。

有研究發(fā)現(xiàn),p70S6K也受到 PDK[7]、MAPK通路的影響。Wang(2001)[30]在對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞施加 ERK直接下游信號(hào)MEK的抑制劑時(shí),發(fā)現(xiàn)p70S6K的活性受到影響。而當(dāng)MEK持續(xù)激活時(shí),p70S6K也表現(xiàn)出持續(xù)激活。而在運(yùn)動(dòng)中,MAPK通路是處于被激活的狀態(tài)。Williamson (2006)[33]觀察在一次較大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)后一段時(shí)間內(nèi),蛋白合成受到抑制,同時(shí),mTOR也明顯受到抑制,但卻仍有一些特異mRNA翻譯增強(qiáng)的情況。發(fā)現(xiàn)p70S6K的活性并未隨著mTOR的抑制而受到強(qiáng)烈的抑制,而是MAPK通路中 ERK1/2信號(hào)的激活下,表現(xiàn)出磷酸化的增強(qiáng)。Widegren(1998)[32]發(fā)現(xiàn),ERK1/2在運(yùn)動(dòng)后即刻是有急劇的升高,達(dá)到安靜值的31±8倍,而隨后慢慢下降。這說(shuō)明運(yùn)動(dòng)后p70S6K的活性也會(huì)受到ERK的影響,這可能會(huì)造成mTOR和p70S6K表現(xiàn)不一致。

p70S6K(Thr389)磷酸化是開(kāi)始均先升高,后下降至最低值,其時(shí)程變化與mTOR蛋白表達(dá)和p70S6K蛋白表達(dá)的反應(yīng)有較大的差異。但相比運(yùn)動(dòng)對(duì)它的影響,低氧對(duì)它的影響似乎更大些,尤其在第14天和第28天表現(xiàn)為非常顯著的抑制。這可能與p70S6K(Thr389)磷酸化較為敏感有關(guān)。Parkington(2003)[21]發(fā)現(xiàn),肌肉收縮活動(dòng)后,Pla肌p70S6K的磷酸化起先變化比較溫和(0.4±0.1倍),但在恢復(fù)期的6 h點(diǎn),Pla肌p70S6K的磷酸化增加了1.4±0.4倍。Baar(1999)[10]也有相似的發(fā)現(xiàn)。這些研究表明,p70S6K的激活具有明顯的時(shí)程變化,即運(yùn)動(dòng)后其磷酸化由于受到抑制,變化不明顯。而后抑制因素漸漸解除,p70S6K的活性增強(qiáng),并于運(yùn)動(dòng)后6 h左右達(dá)峰值,之后再慢慢下降,甚至能持續(xù)到運(yùn)動(dòng)后36 h,它具有明顯的時(shí)程性。而相對(duì)來(lái)說(shuō),其蛋白表達(dá)就不夠敏感。在運(yùn)動(dòng)后第2天時(shí),它的磷酸化可能就已經(jīng)開(kāi)始回落了,而它的蛋白表達(dá)卻仍能繼續(xù)增強(qiáng)。在安靜的時(shí)候,低氧因素對(duì)它磷酸化的抑制效應(yīng)相對(duì)來(lái)說(shuō)影響就更強(qiáng)些。

4 結(jié)論

1.耐力運(yùn)動(dòng)促進(jìn)mTOR/p70S6K通路的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)肌肉蛋白合成。

2.單純低氧暴露可通過(guò)抑制mTOR/p70S6K表達(dá),而抑制肌肉蛋白合成。

3.低氧耐力運(yùn)動(dòng)可削弱低氧對(duì) mTOR/p70S6K表達(dá)的抑制作用。低氧運(yùn)動(dòng)對(duì)mTOR及p70S6K的影響有時(shí)程變化,且有時(shí)程差異。

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Time Course Effects of 4-weeks Hypoxic Exercise on mTOR/p70S6KSignaling Pathway in Skeletal Muscle

ZHAO Hua1,2,ZENG Fan-xing2,ZHANG Li3

Objective:The purpose of this paper was to study the change of mTOR/p70S6Kpathway in 4-weeks hypoxic exercise.Methods:Adult male Sprague-Dawley rats(12-weeks-old) were randomly divided into four groups:NS,NE,HS and HE.The hypoxia circumstance was normal pressure hypoxia,and oxygen concentration is 13.6%,equivalently 3500m above sea level.Total protein content,mTOR and p70S6Ktotal protein,p70S6K(Thr389)phosphorylation of extensor digitorum longus(EDL)muscle were determined by Bradford and Western blot. Results:Hypoxia significantly inhibited mTOR(P<0.01)and p70S6Ktotal protein(P< 0.05)after 3rd day.Exercise promoted mTOR total protein significantly(P<0.01),but hypoxia inhibited it significantly(P<0.01).After 14 days,hypoxia inhibited mTOR total protein significantly(P<0.01)and p70S6K(Thr389)phosphorylation(P<0.01),but exercise promoted p70S6Ktotal protein very significantly(P<0.01).After 28 days,hypoxia inhibited mTOR total protein significantly(P<0.05)and p70S6K(Thr389)phosphorylation(P< 0.01),but exercise significantly promoted mTOR(P<0.01)and p70S6Ktotal protein(P< 0.05).Conclusions:1)Endurance exercise improved muscular protein synthesis through elevated mTOR/p70S6Kpathway.2)Hypoxia exercise inhibited muscular protein synthesis through attenuated mTOR/p70S6Kpathway.3)Endurance exercise in hypoxia attenuated the depression effect of hypoxia on mTOR/p70S6Kpathway.Hypoxic exercise had of time course effective on mTOR and p70S6K.

hypoxic exercise;protein synthesis;m TOR;p70S6K;rat;animal ex periment

G804.2

A

1000-677X(2010)01-0051-11

2009-11-09;

2009-12-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30671013);國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)課題(06-20)。

趙華(1981-),男,湖北荊州人,講師,在讀博士研究生,研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)適應(yīng)的內(nèi)分泌機(jī)制研究,E-mail:zhaohua_ bsu@hotmail.com。

11天水師范學(xué)院體育學(xué)院,甘肅天水741001;21北京體育大學(xué)研究生院,北京100084;31國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所,北京100061

11Physical Education Department,Tianshui Normal University,Tianshui 741001,China;21Beijing Sport University,Beijing 100084,China;31National Institute of Sport Science, Beijing 100061,China.