權(quán)英，孫靜，沈陽，詹月華，張根華，丁建英，秦紅

(蘇州市食品品質(zhì)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟，215500)

丙烯酰胺分子印跡聚合物的制備及其性能研究*

權(quán)英，孫靜，沈陽，詹月華，張根華，丁建英，秦紅

(蘇州市食品品質(zhì)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟，215500)

以丙烯酰胺的結(jié)構(gòu)類似物丙酰胺為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，采用本體聚合法制備出了對丙烯酰胺具有較好選擇性的印跡聚合物。通過振蕩吸附實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出模板分子和功能單體的最佳摩爾比為1∶8;靜態(tài)吸附平衡實(shí)驗(yàn)和Scatchard分析結(jié)果表明，與非印跡聚合物相比，印跡聚合物對丙烯酰胺具有較強(qiáng)的吸附特性，最大吸附量為4.283 mg/g;客體-聚合物的解離常數(shù)KD為2.77μg/mL。紅外光譜分析表明，聚合物的特異性識別位點(diǎn)的形成是由于酰胺鍵和羧基所形成的氫鍵的作用。

丙烯酰胺，分子印跡，吸附

2002年4月瑞典國家食品管理局(national food administration，NFA)和斯德哥爾摩大學(xué)研究人員率先報道，一些富含淀粉類的食物(如炸薯?xiàng)l、面包等)經(jīng)過120℃或更高溫油炸或燒烤能生成一種毒性物質(zhì)—丙烯酰胺。由于丙烯酰胺是一種水溶性的神經(jīng)毒性物質(zhì)，對齟齒動物具有致癌性，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將其歸為對人類很可能具有潛在致癌性的物質(zhì)。該研究結(jié)果已引起包括歐盟、FAO/WHO、美國谷物化學(xué)家協(xié)會(AACC)、FDA、美國食品工藝師協(xié)會(IFT)等國際組織在內(nèi)的廣泛關(guān)注［1］。

目前，丙烯酰胺的檢測方法主要有液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、電噴霧電離(ESI)-碰撞誘導(dǎo)多級反應(yīng)離子掃描監(jiān)測串聯(lián)質(zhì)譜等［2－7］。這些儀器分析方法雖然具有較高的靈敏度，但是其樣品預(yù)處理復(fù)雜，檢測過程繁瑣，所需費(fèi)用較高，而且需要專門的技術(shù)人員。在此背景下，新的檢測技術(shù)或樣品預(yù)處理方法被積極的開發(fā)出來，分子印跡技術(shù)就是其中一項(xiàng)。分子印跡是集高分子合成、物化分子設(shè)計(jì)、分析、分離和測試，生物和醫(yī)學(xué)等眾多相關(guān)學(xué)科的優(yōu)勢，相互滲透而發(fā)展起來的一種材料制備的新技術(shù)，具有高度的特異性和選擇性。

丙烯酰胺中帶有雙鍵容易和其他烯類單體發(fā)生聚合，因此，將丙烯酰胺作為模板分子合成聚合物時，很難將其從印跡聚合物中洗脫，這在痕量分析中會產(chǎn)生假陽性或使檢測結(jié)果偏高。本文采用虛擬印跡技術(shù)［8］，將與丙烯酰胺的空間結(jié)構(gòu)、大小、官能團(tuán)類似的丙酰胺作為模板分子來合成分子印跡聚合物，并對模板分子與功能單體的最佳配比，印跡聚合物的等溫吸附性、動力吸附性、紅外表征等方面進(jìn)行研究。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與儀器

甲基丙烯酸(MAA)(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)(98%，上海奧宇生物科技有限公司)，偶氮二異丁腈(AIBN)(化學(xué)純，上海試四赫維化工有限公司)，丙酰胺(色譜純，美國Sigma-Alorich公司)，丙烯酰胺(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

TU－1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)，超聲波清洗器(上海生析超聲儀器有限公司)，HY－2型調(diào)速多用振蕩器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，索氏脂肪提取器(太倉市華美生化儀器廠)，電熱恒溫干燥箱(上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，TG16－WS臺式高速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，NICOLET380傅立葉紅外光譜儀(美國Thermo公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分子印跡聚合物的制備

采用虛擬印跡方法，選擇丙烯酰胺的結(jié)構(gòu)類似物丙酰胺為模板分子來制備丙烯酰胺分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)。

稱取模板分子丙酰胺和功能單體甲基丙烯酸(MAA)的摩爾比分別為 1∶6、1∶8和1∶10，加入摩爾數(shù)為功能單體5倍的交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，用 N，N-二甲基甲酰胺(DMF)配置成預(yù)聚溶液，超聲混勻，靜置12 h，使其發(fā)生預(yù)聚合。向預(yù)聚溶液中加入偶氮二異丁腈(AIBN)，其中AIBN的質(zhì)量為EGDMA質(zhì)量的1%，超聲波脫氣后轉(zhuǎn)入安培瓶中，封管后放入60℃水浴中引發(fā)聚合24 h。將所得塊狀聚合物粉碎，過250目篩。向聚合物顆粒加入100mL甲醇，超聲波清洗2 h，振蕩過12 h，過濾后用蒸餾水清洗殘余的甲醇，在紫外分光光度計(jì)中于210 nm檢測濾液確認(rèn)無吸收峰，用丙酮進(jìn)行索氏抽提24 h，放入 60℃烘箱烘干［9］。

空白聚合物(non-imprinted polymer，NMIP)的制備方法同上，只是不加模板分子。

1.2.2 單體與模板分子比例的優(yōu)選

采用振蕩吸附實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化模板-單體的最佳比例［10］。

取20 mg不同模板-單體比例的聚合物(MIP或NMIP)，向其中加入20mL濃度為5μg/mL的丙烯酰胺溶液，超聲排氣5 min，振蕩24 h，使之達(dá)到吸附平衡，以5 000 r/min的速度離心沉降10 min。取上清液，測定其在210 nm處的紫外吸光度。同時取20 mg不同模板-單體比例的聚合物，向其中加入20mL的蒸餾水作同樣處理，取上清液作為參比溶液。

1.2.3 印跡聚合物吸附等溫線的測定

具塞錐形瓶中分別加入0.100 g MIP或NMIP和40mL不同濃度的丙烯酰胺溶液，室溫振蕩24 h，使吸附達(dá)到平衡，以5 000 r/min的速度離心沉降10 min。取上清液，測定其在210 nm處的紫外吸光度值。求出吸附達(dá)到平衡后的濃度Δe，計(jì)算吸附量。吸附量的計(jì)算公式為:Q=(co-ce)×V/m×10－3。其中:Q為吸附量(mg/g);co為吸附前溶液中的丙烯酰胺的濃度(μg/mL);ce為吸附達(dá)到平衡后的丙烯酰胺濃度(μg/mL);V為吸附液的體積(mL);m為MIP或 NMIP 的質(zhì)量(g)［11］。

1.2.4 吸附動力學(xué)的測定

具塞錐形瓶中分別加入0.100 g MIP和40mL相同濃度的丙烯酰胺溶液，室溫分別振蕩4、8、12、16、20和24 h，以5 000 r/min的速度離心沉降10 min。取上清液，測定其在210 nm處的吸光度值。計(jì)算不同吸附時間下的吸附量，繪制吸附動力學(xué)曲線［12］。

2.4.2 Tim-3與TGF-β、Smads mRNA的相關(guān)性分析 Tim-3與Smad3呈正相關(guān)（r=0.677，P=0.000）、但與Smad7呈負(fù)相關(guān)（r=-0.446，P=0.006）。Tim-3與TGF-β不相關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.254，P=0.135），見圖2。

1.2.5 印跡聚合物的紅外光譜分析

分別對MIP和NMIP的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行紅外光譜檢測，以獲得分子印跡聚合物的結(jié)構(gòu)信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 丙烯酰胺的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

以蒸餾水為參比溶液，測定結(jié)果表明，丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度在0.2～50μg/mL內(nèi)，測定液的紫外吸光度與其溶液濃度成良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見圖1，回歸方程為y=0.095 6x+0.157 3，其中y為丙烯酰胺溶液在210 nm下的紫外吸光度值，x為丙烯酰胺溶液的濃度，單位為μg/mL。

圖1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.2 優(yōu)化功能單體與模板分子比例

定義Q(mg/g)表示MIP或NMIP的單位吸附量，定義特異因子Y=QMIP/QNMIP，其大小代表MIP的吸附特異性［13］。不同模板-單體分子比例的 MIP的單位吸附量和特異因子如表3所示。

表1 不同模板－單體比例的MIP的吸附性能

從表1的數(shù)據(jù)可以看出，3種不同比例的模板與單體分子制備的MIP中，模板與功能單體比為1∶8的MIP無論是單位吸附量還是特異因子都是最好的，所以選擇1∶8作為模板與單體的最佳配比，來進(jìn)行以下的研究。

2.3 靜態(tài)吸附性能的評價

通過紫外測定，丙烯酰胺的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線可以計(jì)算出分子印跡聚合物吸附丙烯酰胺的量。以丙稀酰胺的吸附溶液初濃度co(μg/mL)為橫坐標(biāo)，MIP或NMIP的單位吸附量Q(mg/g)為縱坐標(biāo)，繪制MIP和NMIP的吸附等溫線(如圖2)。

從圖2看出，MIP的單位吸附量明顯大于NMIP的單位吸附量，且兩者的吸附量之差隨溶液濃度的增加而增大，這說明聚合物的空間結(jié)構(gòu)存在明顯的差異。其原因是印跡聚合物包含有固定排列的功能基的孔穴，其大小和固定排列的功能基與丙烯酰胺分子互補(bǔ)，孔穴對其呈現(xiàn)出“記憶功能”。這顯示了MIP的孔穴效應(yīng)顯著，對目標(biāo)分析物表現(xiàn)出較強(qiáng)的吸附能力。另外，MIP的吸附容量隨著丙烯酰胺分子濃度的增加而增加，當(dāng)丙烯酰胺的質(zhì)量濃度低于30μg/mL時，吸附容量增加速度較快。

圖2 MIP和NMIP的吸附等溫線

2.4 動態(tài)吸附性能的評價

通過紫外測定，丙烯酰胺的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線可以計(jì)算出分子印跡聚合物吸附丙烯酰胺的量。以振蕩時間(h)為橫坐標(biāo)，MIP的單位吸附量Q(mg/g)為縱坐標(biāo)，繪制出MIP的吸附動力學(xué)曲線(如圖3)。從圖3中看出，隨著振蕩時間的增加，MIP對相同濃度的丙烯酰胺的吸附量也隨之增加。當(dāng)振蕩時間小于20 h，MIP的吸附量迅速增加;當(dāng)振蕩時間大于20 h時，MIP的吸附量增加緩慢，到24 h時漸漸趨于平衡。

圖3 MIP的吸附動力學(xué)曲線

2.5 聚合物的Scatchard分析

式中，Q為吸附平衡時MIP對丙烯酰胺的結(jié)合量(mg/g)，c為吸附平衡時溶液中游離的丙烯酰胺的濃度(μg/mL)，Qmax為表觀最大結(jié)合常數(shù)，KD為結(jié)合位點(diǎn)的平衡解離常數(shù)。

以Q(mg/g)為橫坐標(biāo)，Q/c(L/g)為縱坐標(biāo)，繪制出圖3所示的MIP的Scatchard曲線。其中Q(mg/g)代表單位吸附量，c(μg/mL)代表丙烯酰胺的平衡濃度［14］。從圖4中可以看出，Scatchard曲線的線性回歸方程為y= －0.361 6x+1.548 6，R=0.973 1。由直線方程計(jì)算出MIP對丙烯酰胺的最大吸附量為4.283 mg/g，客體－聚合物的解離常數(shù)KD為2.77μg/mL。由上述結(jié)果可以看出，KD值較小，說明聚合物對丙烯酰胺的鍵合能力是較強(qiáng)的。

圖4 MIP的Scatchard曲線

2.6 印跡聚合物的紅外表征

紅外光譜是測定有機(jī)化合物的重要物理方法之一，實(shí)驗(yàn)采用紅外光譜分析法來推斷形成的分子印跡聚合物的結(jié)構(gòu)。將MIP和NMIP進(jìn)行紅外光譜表征(溴化鉀壓片法)，譜圖如圖5、圖6所示。

圖5 NMIP的紅外光譜

圖6 MIP的紅外光譜

紅外光譜分析表明(如圖5、圖6)，MIP中的模板分子丙酰胺與功能單體甲基丙烯酸充分作用后，兩者的主要官能團(tuán)的波數(shù)發(fā)生了變化。由于NMIP中沒有模板分子丙酰胺，而無法說明丙酰胺中的—NH伸縮振動波數(shù)的移動，但可以看出功能單體甲基丙烯酸中的—OH伸縮振動波數(shù)由3 434.04cm－1移動到3 447.88cm－1，C═══O的伸縮振動波數(shù)由1 750.03cm－1移動到1 722.60cm－1。甲基丙烯酸的 C ═══O和—OH的峰發(fā)生了變化，說明可能是由于丙酰胺和甲基丙烯酸產(chǎn)生了氫鍵作用。通過紅外光譜分析，說明印跡分子的選擇特異性可能是由于氫鍵作用形成的，印跡分子丙酰胺和功能單體甲基丙烯酸可進(jìn)行自組裝形成主客體絡(luò)合物，通過加入交聯(lián)劑、引發(fā)劑聚合后被固定下來。當(dāng)丙酰胺被洗脫后MIP留下了與印跡分子結(jié)構(gòu)相似的孔穴，即MIP中通過立體構(gòu)型和結(jié)合位點(diǎn)可對丙酰胺的結(jié)構(gòu)類似物丙烯酰胺進(jìn)行有效識別。

3 結(jié)論

本研究采用虛擬分子印跡技術(shù)，以丙烯酰胺的結(jié)構(gòu)類似物丙酰胺為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，合成出對丙烯酰胺有特異選擇能力的分子印跡聚合物，振蕩吸附試驗(yàn)確定了模板分子與功能單體的最佳摩爾比為1∶8。MIP和NMIP的等溫吸附線表明，MIP形成的孔穴對丙烯酰胺的吸附量明顯高于NMIP。動力吸附線表明，同樣條件下，MIP對相同濃度丙烯酰胺的吸附量在24 h時達(dá)到平衡。紅外光譜分析出特異性識別位點(diǎn)是由于酰胺鍵和羧基形成了氫鍵的作用。Scatchard分析得出聚合物對丙烯酰胺的理論最大吸附量為4.283 mg/g，說明聚合物對丙烯酰胺有較強(qiáng)的吸附性能。

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Study on Preparation and Performances of Acrylamide Molecularly Imprinted Polymers

Quan Ying，Sun Jing，Shen Yang，Zhan Yue-hua，Zhang Gen-hua，Ding Jian-ying，Qin Hong
(Suzhou Key Laboratory of Food Quality and Safety，School of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，China)

The acrylamide molecularly imprinted polymer was synthesized by using propionamide as a template molecular，methacrylic acid as thefunctional monomer，and ethylene glycol dimethacrylate as the cross-linking agent.The optimal molar ratio of templates to monomers was 1∶8.The results of static adsorption equilibrium experiments and scatchard analysis showed:compared with non-imprinted polymer，the imprinted polymer had higher affinity for acrylamide.The max adsorptive capacity was 4.283 mg/g and the dissociation constant(u)was 2.77 g/mL.The infrared spectrum of the polymer indicated that the specific recognition sites in the molecular imprinted polymer were due to the hydrogen bonding effect formed by amide bonds and the carboxyls.

acrylamide，molecular imprinting，adsorption

博士，副教授(張根華教授為通訊作者)。

*江蘇省六大人才高峰資助項(xiàng)目(SZ2010003);蘇州市農(nóng)業(yè)科技公關(guān)項(xiàng)目(SNG0836);蘇州市社會發(fā)展項(xiàng)目(SZD0927)

2010－06－20，改回日期:2010－10－01