歐陽輝，張永康，陳功錫，田啟建

（吉首大學(xué)/植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南吉首416000）

響應(yīng)面法優(yōu)化月見草籽油中γ-亞麻酸的富集工藝參數(shù)

歐陽輝，張永康，陳功錫，田啟建

（吉首大學(xué)/植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南吉首416000）

利用響應(yīng)面法對(duì)月見草籽油中γ－亞麻酸的富集工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上選取實(shí)驗(yàn)因素與水平，根據(jù)中心組合（Box－Benhnken）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法，依據(jù)回歸分析確定各工藝條件的影響因素，以富集產(chǎn)物的γ－亞麻酸含量和γ－亞麻酸的回收率為響應(yīng)值作響應(yīng)面分析，得出最佳工藝條件為：包合溫度為－10℃、尿素/混合脂肪酸（w/w）為3∶1、95%乙醇/混合脂肪酸（v/w）為8∶1，包合時(shí)間為15.6h，此工藝條件下產(chǎn)品中γ－亞麻酸含量可達(dá)53.60%，γ－亞麻酸回收率達(dá)94.48%。

月見草，γ－亞麻酸，尿素包合法，富集，響應(yīng)面

1.1 材料與儀器

超臨界萃取月見草籽油 吉首大學(xué)超臨界流體萃取實(shí)驗(yàn)室提供；無水硫酸鈉、石油醚、無水乙醇、尿素等 均為分析純。

GC－2010型氣相色譜儀、GCMS－QP2010質(zhì)譜儀（NIST05.LIB標(biāo)準(zhǔn)庫） 日本島津公司；FA2004電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠；HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；RE52－99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHB－Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪酸組成及含量測(cè)定

1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)條件 GC條件：GC－2010型氣相色譜儀，色譜柱2m×4mm，填充80～100目ChromosorbW，涂以8%（W/W）二乙二醇琥珀酸酯（DEGS）（3mm× 2.5m），柱溫 210℃，進(jìn)樣器溫度 260℃，氮?dú)饬魉?0mL/min。MS條件：GCMS－QP2010，EI離子源，源溫200℃，電子能量70eV，連接器溫度280℃，運(yùn)行時(shí)間35.5min，質(zhì)量掃描范圍（m/z）：29～600。

1.2.1.2 操作步驟 稱取30～100mg（約2～6滴）油脂，置入10mL量瓶內(nèi)，加入1～2mL正己烷和苯的混合溶劑（1∶1），搖動(dòng)使油脂溶解。加入1～2mL氫氧化鉀（0.4mol·L－1）－甲醇溶液，混勻。在室溫靜置5～10min后，加蒸餾水使全部苯甲酯溶液升至瓶頸上部，放置待澄清（如上清液渾濁而又急待分析時(shí)，可滴入數(shù)滴無水乙醇，1～2min內(nèi)即澄清）。吸取上清液，在室溫下吹入氮?dú)馐蛊錆饪s，所得濃縮液即可用于氣相色譜分析。

1.2.2 混合脂肪酸的制備 超臨界萃取月見草油按一定比例加入3%的NaOH－乙醇溶液，置于錐形瓶中，在60℃的水浴中加熱回流（N2保護(hù)），磁力攪拌1h，得皂化液。冷卻至室溫后，加入適量水使生成的少量皂完全溶解，用10%的HCl溶液酸化混合液至pH2～3，加正己烷萃取，分層，去下層的水層。有機(jī)相水洗至中性，加入無水硫酸鈉脫水，抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸出溶劑，得到混合脂肪酸。

1.2.3 尿素包合法富集γ－亞麻酸響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取混合脂肪酸40g，按照相應(yīng)比例依次加入乙醇、尿素，其中尿素分 3次加入，加入量遞減。60～70℃加熱攪拌1h至溶液透明澄清。室溫冷卻30min后，于不同溫度下進(jìn)行包合反應(yīng)，析出尿素包合結(jié)晶物，一定包合時(shí)間后取出，迅速減壓抽濾除去結(jié)晶，濾液經(jīng)回收乙醇、稀酸及飽和鹽水洗后得到富集γ－亞麻酸產(chǎn)物，稱重后取樣測(cè)定γ－亞麻酸含量。

γ－亞麻酸回收率（%）=（富集產(chǎn)物質(zhì)量×富集產(chǎn)物中γ－亞麻酸含量/混合脂肪酸質(zhì)量）×100%

根據(jù)前期預(yù)備單因素實(shí)驗(yàn)，采用 Design Expert7.16統(tǒng)計(jì)軟件，利用響應(yīng)面方法（RSM）中的Box－Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以包合溫度（℃）、尿素/混合脂肪酸（w/w）、95%乙醇/混合脂肪酸（v/w）和包合時(shí)間（h）四個(gè)因素為自變量，以富集產(chǎn)物的γ－亞麻酸含量和γ－亞麻酸的回收率為響應(yīng)值，每個(gè)因素取三水平，以－1、0、+1編碼，并根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定三因素的零水平和波動(dòng)區(qū)，采用Box－Beheken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)際考察的變量及其實(shí)驗(yàn)水平編碼見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 超臨界萃取月見草油各脂肪酸的組分和含量

超臨界CO2萃取月見草籽油脂肪酸經(jīng)甲酯化處理后，通過色譜數(shù)據(jù)分析，月見草籽油脂肪酸的組成見表2。

表1 中心組合設(shè)計(jì)因素水平表

表2 超臨界萃取月見草油中組分含量結(jié)果表（%）

2.2 月見草籽油提取率中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及響應(yīng)面優(yōu)化分析

按照Box－Beheken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行四因素三水平實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3中，實(shí)驗(yàn)號(hào)1～24是析因?qū)嶒?yàn)，實(shí)驗(yàn)號(hào)25～29是中心實(shí)驗(yàn)。29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。采用Design－Expert軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，回歸分析結(jié)果見表4、表5。

2.3 回歸模型的建立及分析

采用Design－Expert軟件對(duì)表4、表5的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到富集產(chǎn)物中γ－亞麻酸含量和γ－亞麻酸的回收率對(duì)包合溫度、尿素/混合脂肪酸（w/w）、95%乙醇/尿素（v/w）和包合時(shí)間四個(gè)因素的二次多元回歸方程如下：

產(chǎn)物中γ－亞麻酸含量：

表4 響應(yīng)面模型方差分析表（γ－亞麻酸含量）

表5 響應(yīng)面模型方差分析表（γ－亞麻酸回收率）

γ－亞麻酸的回收率：

2.4 工藝條件的確定

根據(jù)回歸模型通過Design Expert軟件分析得出，富集產(chǎn)物的γ－亞麻酸含量和γ－亞麻酸的回收率最高時(shí)的最佳工藝條件是：包合溫度為－10℃、尿素/混合脂肪酸（w/w）為3∶1、95%乙醇/混合脂肪酸（v/w）為8∶1，包合時(shí)間為15.6h，根據(jù)上述條件進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得出實(shí)際富集產(chǎn)物的γ－亞麻酸含量為53.60%，γ－亞麻酸的回收率為94.48%，與預(yù)測(cè)值基本一致，說明該方程與實(shí)際情況擬合很好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性，說明響應(yīng)面法適用于對(duì)尿素包合法富集月見草籽油中γ－亞麻酸的工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

3 結(jié)論

3.1 通過響應(yīng)面分析優(yōu)化的尿素包合法富集超臨界萃取月見草籽油中γ－亞麻酸的最佳條件：包合溫度為－10℃、尿素/混合脂肪酸（w/w）為3∶1、95%乙醇/混合脂肪酸（v/w）為8∶1，包合時(shí)間為15.6h，產(chǎn)品中γ－亞麻酸含量可達(dá) 53.60%，γ－亞麻酸回收率達(dá)94.48%。

3.2 尿素包合法富集超臨界萃取月見草籽油中γ－亞麻酸，條件溫和、工藝簡單、成本低廉，是制備高純度γ－亞麻酸的有效辦法，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供了經(jīng)濟(jì)可行的工藝技術(shù)參考，具有廣闊的前景。

［1］李國棟，范偉，陸國浩，等.月見草油的研究概況［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2003，21（3）：171－173.

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［3］翁新楚，董新偉，任國譜.脲包法在脂類分離技術(shù)中的應(yīng)用［J］.中國油脂，1994，19（6）：40－44.

［4］楊文雄，高彥祥.響應(yīng)面法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.中國食品添加劑，2005（2）：68－71.

［5］LI Q H，F(xiàn)U C L.Application of response surface methodology for extraction optimization of germinant pumpkin seeds protein［J］.Food Chemistry，2005，92（4）：701－706.

Study on optimization of γ－linolenic acid enrichment from evening primrose seeds oil by response surface methodology

OUYANG Hui，ZHANG Yong－kang，CHEN Gong－xi，TIAN Qi－jian
（Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Utilization of Hunan Province/Jishou University，Jishou 416000，China）

Based on single factor tests，the optimum enriching condition of γ－linolenic acid from evening primrose seeds oil with urea adduct method was obtained through Box－Benhnken central combination design and RSM.The results showed that the optimum enriching condition of polysaccharides were as follows：inclusion temperature－10℃，ratio of urea adduct to fatty acid（w/w）was 3∶1，ratio of 95%ethanol to fatty acid（v/w）was 8∶1，inclusion time 15.6h.Under such condition，the purity of γ－linolenic acid was 53.60%，the rate of γ－linolenic acid recovery was 94.48%.

evening primrose；γ－linolenic acid；urea adduct method；enrichment；response surface methodology

TS225.1+4

B

1002－0306（2010）12－0243－04

月見草（Oenothera biennis L.）系柳葉菜科1年或2年生草本植物，俗名山芝麻，由于夜間開花，花朵黃色，淡香幽雅，又名夜來香。據(jù)文獻(xiàn)資料記錄，月見草種子含油20%～30%，其中γ－亞麻酸約7%～14%左右［1］。γ－亞麻酸是人體必需的不飽和脂肪酸，是人體內(nèi)具有重要的生理活性的組成物質(zhì)［2］。尿素包合法是不飽和脂肪酸的常用富集方法，其基本特點(diǎn)是可將混合物脂肪酸按飽和度的差異進(jìn)行分離。其優(yōu)勢(shì)在于：設(shè)備簡單，工藝簡便，不在高溫下進(jìn)行反應(yīng)，脲包物形成后，還可有效地保護(hù)雙鍵不受氧化，不會(huì)對(duì)不飽和脂肪酸的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)產(chǎn)生影響，能較完全地保留其營養(yǎng)與生理活性［3］。響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）是一種優(yōu)化反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)的有效方法，廣泛應(yīng)用于化學(xué)化工、生物工程、食品工業(yè)等方面［4］。它與正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法不同，具有實(shí)驗(yàn)周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)［5］。本研究以富集產(chǎn)物的γ－亞麻酸含量和γ－亞麻酸的回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以包合溫度、尿素/混合脂肪酸比例、95%乙醇/混合脂肪酸比例和包合時(shí)間四個(gè)因素為自變量，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化尿素包合法富集月見草籽油中γ－亞麻酸的工藝條件，得到最佳富集參數(shù)，為更好地利用我國月見草資源，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

2009－11－13

歐陽輝（1979－），男，理學(xué)學(xué)士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事天然生物活性成分研究。

湖南省教育廳重點(diǎn)資金資助項(xiàng)目（02A037）。